天然促生長因子促進益生菌發酵牛骨粉鈣轉化的工藝優化

吳 敏，羅愛平*，尹彥洋，劉芝澤

(1.銅仁職業技術學院計算機應用系，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

天然促生長因子促進益生菌發酵牛骨粉鈣轉化的工藝優化

吳 敏1，羅愛平2,*，尹彥洋2，劉芝澤2

(1.銅仁職業技術學院計算機應用系，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

利用益生菌發酵牛骨粉，添加8種天然益生菌促生長因子協同發酵牛骨粉。通過單因素試驗，篩選益生菌促生長因子。采用L9(34)正交試驗設計，以游離鈣轉化率為特征性指標，優化幾種天然促生長因子的最佳組合。單因素試驗結果表明：玉米汁、番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡蘿卜汁、牛奶均對益生菌有促生長作用，除玉米汁外，發酵終止時的pH值越低、活菌數越大，鈣轉化率越高。白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米汁為5%。馬鈴薯汁對鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌及兩者協同發酵時均有抑制作用。正交試驗結果表明：番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡蘿卜汁4種促生長因子協同發酵牛骨粉鈣轉化率的最優組合為：白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%，在該條件下鈣轉化率可達38.8%。

益生菌；牛骨粉；促生長因子；鈣轉化率

Abstract：Natural growth-promoting factors were added to probiotic fermentation of fresh cattle bone meal for exploring the synergistic effect on the conversion rate of calcium. Single factor experiments were used to select probiotics. Meanwhile,orthogonal experiments were used to explore the optimal combination of growth factors on the basis of conversion rate of free calcium. Results indicated that corn juice, tomato juice, bean sprout juice, cabbage juice, carrot juice and milk have obvious growth-promoting effect on probiotics. Except for corn juice, the lower pH at the end of fermentation could result in the greater number of viable cells and the higher conversion rate of calcium. In addition, the optimal addition amount of cabbage juice, tomato juice, bean sprout juice and milk was 15%, whereas 20% for carrot juice and 5% for corn juice. Potato juice exhibited an inhibitory effect on the fermentation ofLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus acidophilus, and their combinatorial fermentation.Orthogonal experimental results showed that the optimal combinatorial formula of four growth-promoting factors were 18.0%cabbage juices, 15.0% bean sprout juice, 12.0% tomato juice and 20.0% carrot juice. The conversion rate of calcium was up to 38.8% at the condition of this optimal combinatorial formula.

Key words：probiotics；bovine bone meal；growth-promoting factor；conversion rate of calcium

利用益生菌發酵含適宜鈣磷比(2:1)的牛骨粉[1]，不僅由于乳酸菌代謝產生的酸使結合態的鈣轉變為游離態[2]，而且水解牛骨蛋白，提供了輔助鈣吸收的氨基酸和磷[3]。由于益生菌的不完全蛋白分解酶系，其生長所需的低氧化還原電勢及對微量元素的需求，一般發酵液很難滿足，導致發酵效率偏低[4-5]。天然促生長因子，如白菜汁、胡蘿卜汁、番茄汁、豆芽汁等含有益生菌生長所必需的氨基酸和蛋白質，同時還含有益生菌生長所需的維生素和微量元素，可促進益生菌生長繁殖，提高其發酵效率[6]。

本研究在益生菌發酵牛骨粉實驗基礎上，通過添加制作簡便、來源豐富、成本低、增殖明顯的天然益生菌促生長因子，提高產品中益生菌的活菌數與鈣轉化率。通過對益生菌增殖因子的篩選，確定促生長因子的添加量，優化促生長因子的組合。進一步將補鈣劑與促進鈣吸收利用的微生態調節劑有機地結合在一起。為開發生物態補鈣制劑提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料

牛骨粉由貴州大學生命科學學院食品營養與安全系提供；雪花牌啤酒，購于貴陽花溪佳宇超市。

1.2 儀器與設備

HI208磁力攪拌多用綜合酸度測定儀 北京哈納科儀科技有限公司；LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器 上海長城儀表廠；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHP-250型智能生化培養箱 上海興都儀器設備有限公司。

①項目區的劃定主要是以鄉鎮為基本范圍，但不限于按鄉鎮劃分。根據規劃投資控制規模，統籌考慮各級政府資金配套、資金整合和資金籌措能力，遵循“相對集中、地方自愿、公開公正”的原則合理選擇項目區。

1.3 菌種與培養基

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，LGG)，菌種編號1.2466；嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，LA)，菌種編號1.1854；均購于中國科學院微生物研究所。

鼠李糖乳桿菌與嗜酸乳桿菌活化培養基均為MRS培養基(未添加碳酸鈣)。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將菌種進行活化復壯，測其活菌數[7]。以24h內達到對數生長期(活菌數＞106CFU/mL)為止。

1.4.2 菌種擴大培養

菌種活化后，以3%的比例接種于種子液，37℃100r/min 振蕩培養，測其活菌數，以24h內達到對數生長期(活菌數＞ 106CFU/mL)為止[8]。

1.4.3 牛骨粉發酵液制備

按質量濃度骨粉5g/100mL、葡萄糖11g/100mL、雙蒸水84%，pH6.2制備牛骨粉發酵液[8]。

1.4.4 天然促生長因子的篩選

1.4.4.1 天然促生長因子的制備

豆芽汁：豆芽500g洗凈，加少量蒸餾水制漿，煮沸15min，四層紗布過濾，加水調節濾液的質量，使豆芽與濾液的比例1:1.5(m/V)，再將濾液2500r/min離心10min，除去固體雜質，取上清液，置－15℃備用；白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁和玉米汁制備方法與豆芽汁相同；牛奶經脫脂處理后置－15℃備用。

促生長因子的初步篩選：在MRS培養基中分別添加體積分數10%的豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒，發酵20h，同時做空白實驗，以活菌數為特征性指標，篩選促LGG、LA生長因子。

促生長因子的確定：采用單因素試驗設計。將初步篩選的促生長因子分別按體積分數5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%的用量添加到發酵液中，以接種量3%，菌種LGG:LA為4.67:1(m/m)，37℃、100r/min振蕩培養69.96h[7]以鈣轉化率為評定指標，篩選出具有明顯促進鈣轉化的促生長因子及添加量。

1.4.5 天然促生長因子促進益生菌發酵牛骨粉的工藝優化

在單因素試驗的基礎上，選取影響鈣轉化率較為明顯的4種促生長因子，采用L9(34)正交試驗，以鈣轉化率為評定指標，對4種促生長因子協同發酵牛骨粉條件進行優化。

1.4.6 測定指標

1.4.6.1 骨粉中水分測定

按照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量測定》中的直接干燥法測定。

1.4.6.2 鈣轉化率測定

鈣含量測定：采用GB/T 9695.13—2009《肉與肉制品鈣含量測定》中的高錳酸鉀滴定法測定。

1.4.6.3 pH值測定

在(25.0±0.5)℃條件下，采用HI208磁力攪拌多用綜合酸度測定儀測定各發酵液pH值。

1.4.6.4 活菌數測定

按照GB/T 4789.35—2008《食品衛生微生物學檢驗乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗》中的平板傾注法測定。

1.5 數據處理

采用SPSS 12.0統計分析軟件進行顯著性分析，用Origin 7.0軟件繪制圖形，每個指標重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 骨粉成分測定結果

隨機取樣平行測定，測得本實驗中所制備的原料牛骨粉的平均含水率為7.63%；平均鈣含量為2.05×104mg/100g。

表1 不同促生長因子對益生菌活菌數的影響Table 1 Effects of growth-promoting factors on the number of viable probiotics CFU/mL

2.2 促生長因子對益生菌生長的影響

2.2.1 促生長因子篩選實驗

據報道[10-15]，豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒等有促進乳酸菌生長的作用，選擇這8種天然營養物質作為促進益生菌生長因子。不同促生長因子促進益生菌生長情況見表1。

由表1可知，LGG組：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁活菌數分別為3.22×1011、1.45×1011、37.2×1011、19.8×1011CFU/mL，均明顯高于空白組0.58×1011CFU/mL，表明其對LGG生長有明顯促進作用；牛奶、玉米汁活菌數與空白組無顯著性差異，即牛奶、玉米汁對LGG的促生長效果不顯著。馬鈴薯汁、啤酒活菌數均低于空白組，表明其對LGG的生長有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁對LG G的促生長效果大小為：番茄汁＞胡蘿卜汁＞白菜汁＞豆芽汁。

LA組：白菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、啤酒、玉米汁活菌數分別為12.29×109、7.78×109、13.13×109、2.01×109、2.02×109CFU/mL均明顯高于空白組1.15×109CFU/mL，表明它們促LA生長效果明顯。牛奶、豆芽汁活菌數與空白組無顯著性差異，即牛奶與豆芽汁對LA的促生長效果不明顯。馬鈴薯汁活菌數低于空白組，表明其對LA生長有抑制作用。不同促生長因子對LA的促生效果大小為：胡蘿卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒≈玉米。

LGG:LA組：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁活菌數分別為5.82×1010、2.43×1010、4.36×1010、3.39×1010CFU/mL均明顯高于空白組0.88×1010CFU/mL，均能促進LGG與LA共生。牛奶、啤酒、玉米汁活菌數與空白組無顯著性差異，即牛奶對LGG與LA共同生長無明顯的促進作用。馬鈴薯汁活菌數低于空白組，表明其對LGG與LA生長有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁4種促LGG與LA共生作用的效果為：白菜汁＞番茄汁＞胡蘿卜汁＞豆芽汁。

綜上所述，馬鈴薯對LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其機理有待進一步研究。根據8個促生長因子對LGG與LA促生長效果的大小，并與空白組比較，舍去啤酒與馬鈴薯汁兩種對益生菌無明顯促生長效果或有抑制作用的因子，對其余6個促生長因子進一步篩選。

2.2.2 單因素試驗結果

不同促生長因子中鈣含量有所差異，為排除其對試驗結果產生的影響，對各促生長因子中鈣含量進行測定，結果見表2。再進行單因素試驗設計，結果見表3。

表2 各促生長因子中的鈣含量Table 2 Calcium contents of growth-promoting factors

表3 單因素試驗主要測定指標結果Table 3 Effects of type and amount of added growth-promoting factors on conversion rate of calcium

由表3可知，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量在5.0%～15.0%時，鈣轉化率隨白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量的增大而升高，添加量為15.0%時達最大值，分別為31.75%、31.75%、30.48%、24.13%，比最小值分別提高13.64%、19.05%、20.00%、15.23%。添加量在15%～25%時，鈣轉化率隨添加量的增大而降低；胡蘿卜汁添加量在5.0%～20.0%時，鈣轉化率隨胡蘿卜汁添加量的增大而升高，添加量為20.0%時達最大值33.34%，比最小值26.94%，提高23.76%。胡蘿卜汁添加量在20.0%～25.0%時，鈣轉化率隨胡蘿卜汁添加量的增大而降低；隨玉米汁添加量的增大，鈣轉化率降低。添加量為5.0%時達29.21%，比最小值提高29.59%。結果表明，玉米汁的添加量與鈣轉化率成反比。

綜上所述：適量濃度的白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶、胡蘿卜汁有利于益生菌生長，有助于骨粉中鈣轉化率提高。

如表3所示，添加量過大也會抑制益生菌的生長，降低鈣轉化率。結果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量為15.0%為宜。胡蘿卜汁添加量20.0%為宜。

單因素試驗結果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米為5%。除玉米汁試驗組外，pH值越低、活菌數越大，鈣轉化率越高。用SPSS 12.0軟件對不同促生長因子pH值、活菌數和鈣轉化率進行相關性分析，得出pH值、活菌數與鈣轉化率之間無顯著(P＞0.05)的相關性。

2.3 益生菌發酵正交試驗

為進一步提高鈣轉化率，選取胡蘿卜汁、番茄汁、豆芽汁和白菜汁4種促鈣轉化效果明顯的促生長因子為因素，采用L9(34)正交試驗設計，以鈣轉化率為指標評價4種促生因子協同作用對益生菌發酵牛骨粉鈣轉化率的影響。

表4 L9(34)正交試驗結果與分析Table 4 Orthogonal array design layout and experimental results

由表5中極差分析可知，4個因素對鈣轉化率的影響次序是：C＞B＞A＞D，即番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡蘿卜汁。最優組合為A3B2C1D2，即白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%。經驗證性實驗結果顯示鈣轉化率為38.8%。此結果與第8組試驗組A3B2C1D3鈣轉化率達最大值38.1%的結果極為相近，相對偏差僅1.84%，只影響效果最小的D因素不同，表明試驗的最佳理論組與實際相符合，結果可靠。

4 結 論

4.1 豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶、啤酒8種對LGG的促生效果大小為：番茄汁＞胡蘿卜汁＞白菜汁＞豆芽汁＞空白牛奶，玉米汁、啤酒對LGG的促生長效果不明顯；對LA的促生長效果大小為：胡蘿卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒、玉米汁＞空白，牛奶、豆芽汁對LA的促生長效果不明顯；對LGG＋LA的促生長效果大小為：白菜汁＞番茄汁＞胡蘿卜汁＞豆芽汁＞空白，牛奶、玉米汁、啤酒對LGG＋LA的促生效果不明顯。而馬鈴薯對LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其機理有待進一步研究。

4.2 單因素試驗結果表明，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米汁為5%。除玉米汁外，發酵終止時的pH值越低、活菌數越大，鈣轉化率越高。

4.3 正交試驗結果表明，4種促生長因子協同發酵牛骨粉鈣轉化率影響主次因素為番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡蘿卜汁。最優組合為白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%、鈣轉化率可達38.8%。

4.4 天然促生長因子的原料如豆芽、白菜、番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、玉米等因采收季節、地域、品種不同，營養成分含量有所差異，如何保證其對益生菌的促生長效果穩定有待進一步研究。

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Optimization of Amounts of Added Natural Growth-promoting Factors for Fermentation of Cattle Bone Meal by Probiotics for Calcium Conversion

WU Min1，LUO Ai-ping2,*，YIN Yan-yang2，LIU Zhi-ze2
(1. Department of Computer and Applications, Tongren Polytechnic, Tongren 554300, China；2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

TS251.2

A

1002-6630(2010)21-0222-04

2010-01-20

貴州省科技廳資助項目(黔科合NY字[2007]3021號)；貴州現代肉牛產業技術體系建設項目(GZCYTX-0301-03)

吳敏(1968—)，女，副教授，碩士，主要從事畜產品加工研究與開發。E-mail：trzywumin@163.com

*通信作者：羅愛平(1958—)，女，教授，本科，主要從事畜產品加工研究與開發。E-mail：luoaiping58@126.com