芝麻蛋白酶解液的抗氧化性能

陳曉剛，劉愛(ài)文，陳 忻，藍(lán)建軍

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東 佛山 528000)

芝麻蛋白酶解液的抗氧化性能

陳曉剛，劉愛(ài)文，陳 忻，藍(lán)建軍

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東 佛山 528000)

以黑芝麻為原料，制備芝麻蛋白；分別用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解制得酶解液，然后對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性能研究。以對(duì)自由基的清除率為考察指標(biāo)，篩選出較優(yōu)單酶，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：中性蛋白酶為最優(yōu)單酶，其酶解液具有良好的抗氧化性能，能有效清除體外自由基，其中對(duì)羥自由基(·OH)的清除率最高可達(dá)到94.84%，對(duì)超氧陰離子自由基(O2·)清除率最高可達(dá)到74.78%，而對(duì)脂過(guò)氧化自由基(ROO·)清除率為43.63%；酶解時(shí)的pH值、酶解溫度是影響酶解效果的主要因素。

芝麻蛋白；抗氧化；自由基

Abstract：Black sesame protein was prepared by alkaline extraction and acid precipitation, and then subjected to single enzymatic hydrolysis with neutral proteinase, papain and alkaline protease. Neutral protease was screened out of the three proteases for preparing black sesame protein with higher free radical scavenging activity. Additionaly, the optimization of respective conditions for neutral protease hydrolysis for achieving maximum scavenging rates for hydroxyl, superoxide anion and peroxyl free radicals was carried out using orthogonal array design, and the results showed that the maximum scavenging rates for the above three species of radicals were up to 94.84%, 74.78% and 43.63%, respectively, under optimized hydrolysis conditions.

Key words：sesame protein；antioxidant activity；free radical

在生物機(jī)體生命活動(dòng)過(guò)程中，新陳代謝不斷發(fā)生氧化和還原反應(yīng)，氧化代謝會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基。而自由基與機(jī)體內(nèi)多種功能性障礙和疾病發(fā)生有關(guān)，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要原因。自由基也會(huì)直接影響到人體細(xì)胞健康，如攻擊生物大分子造成組織細(xì)胞損傷等。近年來(lái)的研究表明作為抗氧化劑，蛋白質(zhì)類物質(zhì)中最有前途的當(dāng)屬肽類。肽類不僅在油溶體系中有良好的增效作用，如雙肽對(duì)α,β-生育酚有增效作用，而且在水溶體系、乳化體系及干燥體系中也有較高的抗氧化能力[1-3]。因此，合理開(kāi)發(fā)利用植物蛋白，提高蛋白質(zhì)的利用率，對(duì)提高蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)利益和改善我國(guó)人民膳食結(jié)構(gòu)具有很大的意義。

芝麻作為我國(guó)四大油料之一，生產(chǎn)豐盛，占世界栽培面積的13.5%。據(jù)現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)分析，芝麻種子既含較高的油(含油46%～62%)，也含有較高的蛋白質(zhì)(含蛋白質(zhì)20%～25%)，芝麻蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有VA、VD及豐富的B族維生素。芝麻蛋白與其他植物蛋白相比，富含含硫氨基酸，尤其是蛋氨酸(Met)，顯著高于其他植物蛋白，且無(wú)抗?fàn)I養(yǎng)因子，所含的氨基酸除賴氨酸略低外，其他氨基酸可以與牛肉或酪蛋白相媲美，接近或達(dá)到FAO/WHO建議的優(yōu)質(zhì)蛋白[4]。目前，芝麻除直接食用外，大部分都用來(lái)榨油，榨油后的副產(chǎn)品芝麻渣或芝麻餅的蛋白質(zhì)含量能達(dá)到40%～60%，但通常把它作飼料或直接作肥料用，使蛋白質(zhì)資源未得到充分利用。

目前，對(duì)芝麻蛋白質(zhì)的研究?jī)H局限提取及其基本性質(zhì)，對(duì)其蛋白質(zhì)的改性以及活性短肽的抗氧化作用的報(bào)道很少，特別是對(duì)其酶解及酶解產(chǎn)物性質(zhì)更是不見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)以芝麻蛋白為原料，對(duì)其在不同體系中的抗氧化作用進(jìn)行較為系統(tǒng)深入的研究，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用芝麻蛋白活性肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑芝麻 佛山新一佳超市。

中性蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司；以上試劑均為生物酶制劑。

1.2 儀器與設(shè)備

722光柵分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；PHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；FA2004N電子分析天平 上海精密儀器有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 江蘇金壇市富華儀器有限公司；85-2控溫磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠；SYC-15超級(jí)恒溫水浴 南京桑力電子設(shè)備廠；800型離心沉淀器 上海手術(shù)器械廠； WH95-1多功能攪拌機(jī) 佛山市順德白馬電器塑料廠；電爐 高勝五金電器廠；CS101-2E型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱、電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海訊能電熱設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芝麻蛋白的提取[5-7]

芝麻蛋白主要是堿溶性蛋白，在堿性條件下溶解度較大，所以采用堿提酸沉法。

稱取200.0g脫脂芝麻加水，料液比為1:10，攪拌均勻。加入一定量的0.5g/100mL NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10.0，控制溫度在50℃，緩慢攪拌，使蛋白質(zhì)在堿性狀態(tài)下溶解，一般溶解時(shí)間為4h，離心分離，得到蛋白液。取上述蛋白液調(diào)節(jié)pH值至芝麻蛋白的等電點(diǎn)(pH4.5左右)，靜置，沉淀，干燥得到芝麻分離蛋白。

1.3.2 芝麻蛋白酶解液的制備工藝[8-11]

預(yù)處理：稱取1.0g芝麻蛋白若干份，加入一定比例的水勻漿，調(diào)節(jié)適宜pH值，于恒溫水浴鍋中加熱至預(yù)設(shè)定的酶解溫度。酶解處理：待芝麻蛋白水溶液的溫度達(dá)到預(yù)設(shè)值時(shí)，加入定量的酶，置于確定溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)計(jì)時(shí)進(jìn)行酶解。整個(gè)酶解過(guò)程需不停攪拌以保證反應(yīng)充分。滅酶處理：酶解結(jié)束后，水解液立即置于沸水浴中10min加熱滅酶，冷卻反應(yīng)液于4000r/min離心10min得到芝麻蛋白水解液，測(cè)量水解上清液體積，然后冷藏保存。

1.3.3 芝麻蛋白未酶解液的制備

稱取1.0g芝麻蛋白若干份，加入一定比例的水勻漿，經(jīng)離心后得芝麻蛋白未酶解液。

1.3.4 氧化性能實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 羥自由基(·OH)的清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12-15]，取1mL 0.75mmol/L 鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中依次加入2mL 0.2mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液 (PBS，pH7.40)和1mL蒸餾水，充分混勻后，加入1mL 0.75mmol/L硫酸亞鐵銨溶液，混勻后，加入1mL 0.01% H2O2，于37℃水浴60min后，在波長(zhǎng)536nm測(cè)其吸光度為損傷管的吸光度A損傷。未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中1mL 0.01%的H2O2，操作方法同損傷管，可測(cè)波長(zhǎng)536nm處未損傷管的吸光度A未損傷。樣品管以1mL芝麻蛋白酶解液代替損傷管中的1mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測(cè)得536nm波長(zhǎng)處樣品管的吸光度A試樣。測(cè)定吸光度時(shí)均以蒸餾水調(diào)零。·OH的清除率計(jì)算按照公式(1)進(jìn)行。

1.3.4.2 超氧陰離子自由基(O2·)的清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[16-19]，在試管中依次加入1.7mL 0.06mol/L pH8.04 PBS，0.3mL 130mmol/L Met溶液，0.3mL 750μmol/L NBT溶液，0.3mL 100μmol/L EDTA溶液，0.3mL 20μmol/L VB2溶液，0.1mL芝麻蛋白酶解液(空白樣、參比樣以蒸餾水代替)，參比樣加完藥品立刻放入黑暗處，其他各樣置于30℃恒溫水浴中，上懸30W的熒光燈，距離15cm，打開(kāi)熒光燈準(zhǔn)確照射90min。停止光照，以黑暗處的參比樣為空白調(diào)零，于560nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。清除率按照公式(2)計(jì)算。

式中：A0為空白樣的吸光度；As為加試樣的吸光度。

1.3.4.3 脂過(guò)氧化自由基(ROO·)的清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[20]，將5mL無(wú)水乙醇、5mL pH8.04的PBS、一定量的芝麻蛋白酶解液與0.1mL亞油酸混合，用30W紫外燈光照射60min，然后加入4mL 20g/100mL的三氯乙酸溶液，1mL 3g/100mL的硫代巴比妥酸，90℃水浴反應(yīng)90min，冰浴，用滴管將試管上的油層吸走，若有懸浮物則需離心，于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水代替試樣作為空白對(duì)照。ROO·清除率按照公式(3)計(jì)算。

式中：A0為空白樣的吸光度；As為加試樣的吸光度。

1.3.4.4 未酶解液對(duì)·O H、O2·、ROO·的清除

利用芝麻蛋白未酶解液代替酶解液進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

表1 3種酶解液對(duì)·OH、O2·、ROO·的清除率Table 1 Enzyme screening for obtaining black sesame protein hydrolysate with higher scavenging rates for hydroxyl, superoxide anion and peroxyl free radicals

由表1可知，3種酶解液對(duì)自由基的清除能力強(qiáng)弱，無(wú)論是清除·OH，還是O2·、ROO·，中性蛋白酶都是最優(yōu)的，木瓜蛋白酶次之，堿性蛋白酶最差。所以選擇中性蛋白酶作為最優(yōu)酶，并用之作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)酶解條件優(yōu)化的單酶。

2.2 中性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

表2 中性蛋白酶酶解液的L55正交試驗(yàn)表Table 2 L55orthogonal array design and experimental results

選擇A(酶解溫度)、B(酶解時(shí)間)、C(pH 值)、D(酶與底物質(zhì)量比)、E(底物質(zhì)量濃度)5個(gè)因素，用上述所選的中性蛋白酶的酶解液做L55正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各因素對(duì)芝麻蛋白酶解液清除·OH能力影響的主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D＞E，即：pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶與底物質(zhì)量比＞底物質(zhì)量濃度，最優(yōu)水平組為A3B3C2D4E4，即酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為4.0h、pH7.0、酶與底物質(zhì)量比2.5%、底物質(zhì)量濃度4.0g/100mL。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)·OH的清除率可達(dá)94.84%。

各因素對(duì)芝麻蛋白酶解液清除脂過(guò)氧化自由基能力影響的主次順序?yàn)镋＞A＞D＞C＞B，即：底物質(zhì)量濃度＞酶解溫度＞酶與底物質(zhì)量比＞pH值＞酶解時(shí)間，最優(yōu)水平組為A3B5C1D3E1，即酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為5.0h、pH6.5、酶與底物質(zhì)量比2.0%、底物質(zhì)量濃度1.0g/100mL。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)ROO·的清除率可達(dá)43.63%。

2.3 未酶解液清除自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 未酶解液對(duì)·OH、O和ROO·的清除率Table 3 Scavenging rates for hydroxyl, superoxide anion and peroxyl free radicals of black sesame protein

表3 未酶解液對(duì)·OH、O和ROO·的清除率Table 3 Scavenging rates for hydroxyl, superoxide anion and peroxyl free radicals of black sesame protein

未酶解液體積/mL ·OH清除率/% O2·清除率/% ROO·清除率/%0.1 2.01 1.94 1.020.2 1.84 2.62 1.460.3 0.27 1.63 1.810.4 0.10 0.91 0.680.5 0.00 0.67 0.420.6 0.05 0.56 0.11

3 結(jié) 論

以抗氧化性能為考察指標(biāo)，幾種蛋白酶的芝麻蛋白酶解液清除·的效果依次為：中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶。中性蛋白酶的芝麻蛋白酶解液具有良好的抗氧化性能，能有效清除各種體外自由基，其中對(duì)·OH的清除率最高可達(dá)到94.84%，對(duì)清除率最高可達(dá)到74.78%，對(duì)ROO·清除率達(dá)43.63%。而未酶解液只有很弱的甚至沒(méi)有清除能力。酶解時(shí)的pH值、酶解溫度是影響酶解效果的主要因素。

[1] KIMIKAZU I, MASAHIKO H, FUMIO I. Prominent antioxidant effect of wheat gliadin on linoleate peroxidation in powder model systems at high water activity[J]. Agric Food Chem, 1987, 35:628-631.

[2] JIN Y W, KENSHIRO F, TERUO M, et al. Antioxidative mechanism of maize zein in powdermodel systems against methyl linoleate:effect of water activity and coexistence of antioxidants[J]. Agric Food Chem,1991, 39:351-355.

[3] LAWRENCE M T, SHIGEFUMI S, McCLEMENTS D J, et al. Mechanisms of the antioxidant activity of a high molecular weight fraction of whey[J]. Agric Food Chem, 2000, 48:1473-1478.

[4] ADLER-NISSEN J. Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. London:Elsevier Applied Scienee Publishers Led, 1986.

[5] 金青哲. 芝麻蛋白提取工藝研究[J]. 糧食與油脂, 1999(3):19-21.

[6] CHUN S S, CHO Y J, KIM Y H, et al.Change of functional properties and extraction of protein from abolished protein resource by phytate[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition,1998, 27(1):46-50.

[7] 李干紅,丁曉雯. 芝麻蛋白酶解條件控制及其產(chǎn)物抗氧化研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2006, 21(1):104-108.

[8] 陳興勇, 王偉, 濃宗根, 等. 芝麻蛋白水解工藝的研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2006(9):17-20.

[9] 李鳳霞, 陳乃強(qiáng), 張鐘. 芝麻肽最適酶類的選擇與水解條件的確定[J]. 糧油食品科技, 2007, 5(2):50-51.

[10] ALOBO A P. Effect of sesame seed flour on millet biscuit characteristics[J]. Plant Foods for Human Nutrition (Formerly Qualitas Plantarum),2001, 56(2):195-202.

[11] 吳疆, 童應(yīng)凱, 金紅, 等. 堿性蛋白酶水解玉米蛋白的研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2007(2):26-27.

[12] 文鏡, 賀素華. 楊育穎, 等. 保健食品清除自由基作用的體外測(cè)定方法和原理[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(1):190-195.

[13] 金青哲, 劉元法, 王興國(guó), 等. 芝麻素抗氧化性的初步研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2005, 20(4):89-97.

[14] 金鳴, 蔡亞欣, 李金榮, 等. 鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)產(chǎn)生的羥自由基[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1996, 23(6):553-555.

[15] 谷學(xué)新, 邰超. 一個(gè)新的測(cè)定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH及清除的熒光方法[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 18(6):460-463.

[16] 楊立, 韋統(tǒng)師, 沈序維, 等. 簡(jiǎn)明化學(xué)手冊(cè)[M]. 蘭州:甘肅人民出版社, 1980:787-789.

[17] 許鋼, 張虹, 董建紅. 竹葉提取物清除和·OH的研究[J]. 浙江林業(yè)科技, 2000, 20(3):17-21.

[18] 許鋼. 靈芝提取液清除自由基能力[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 24(1):89-94.

[19] 張虹, 許鋼, 張輝. 六月霜中提取物清除O2·和·OH[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 19(6):574-578.

[20] 范曉, 嚴(yán)小軍, 房國(guó)明. 高分子量褐藻多酚抗氧化性質(zhì)研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 1999, 23(5):494-499.

Optimization of Enzymatic Preparation of Antioxidant Black Sesame Protein Hydrolysate

CHEN Xiao-gang，LIU Ai-wen，CHEN Xin，LAN Jian-jun
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Foshan University, Foshan 528000, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)21-0085-04

2010-07-20

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KZCX2-YW-209)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2008BAD94B08)

陳曉剛(1979—)，男，講師，碩士，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。E-mail：fscxg@189.cn