水產(chǎn)品中添加劑多聚磷酸鹽抑菌效果的研究

沈 飚，胡興娟，徐君輝，貝文聯(lián)，吳祖芳

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

水產(chǎn)品中添加劑多聚磷酸鹽抑菌效果的研究

沈 飚1，胡興娟1，徐君輝1，貝文聯(lián)1，吳祖芳2

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

目的：分析多聚磷酸鹽中主要抑菌成分，并找出臨界抑菌濃度。方法：利用微生物法，用pH值分別為6.0、7.2、8.0的檢測(cè)瓊脂研究正磷酸鹽、三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽和三偏磷酸鹽對(duì)枯草芽孢桿菌和滕黃微球菌的抑菌作用。結(jié)果：三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽是影響抑菌效果的主要因素，其引起抑菌劑陽性的臨界質(zhì)量濃度分別為0.2g/100mL 和0.2g/100mL，用P2O5計(jì)分別為1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。通過對(duì)三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽進(jìn)行兩因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)兩者互存時(shí)，只要有一種質(zhì)量濃度達(dá)到臨界值就會(huì)產(chǎn)生抑菌陽性效果(抑菌圈寬度≥2mm)。結(jié)論：通過控制焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽使用量，可降低由多聚磷酸鹽引起的抑菌劑陽性風(fēng)險(xiǎn)。

多聚磷酸鹽；三聚磷酸鹽；焦磷酸鹽；抑菌；微生物方法

Abstract：Objective:To find out which ones of four polyphosphates are antimicrobial molecules and to determine their critical antimicrobial concentrations. Methods:Liquid agars at different pH values (6.0, 7.2 and 8.0) were used to test the inhibitory effects of orthophosphate, tripolyphosphate, pyrophosphate and trimetaphosphate onBacillus subtilisandMicrococcus luteus.Results:Two of the four polyphosphates were an antimicrobial, including tripolyphosphate and pyrophosphate. Their critical concentrations causing antimicrobial positivity were 0.2 g/100mL and 0.3 g/100 mL (1157.56 mg/kg and 1601.43 mg/kg,calculated as P2O5), respectively. A two-factor, three-level orthogonal array design was employed to evaluate the synergistic antimicrobial effect of tripolyphosphate and pyrophosphate, and the results revealed that as long as one of the two polyphosphates simultaneously added had a concentration in their mixed solution equalling or exceeding its own critical concentration, a positive antimicrobial result (inhibition zone equalling or exceeding 2 mm) could be observed. Conclusion:The risk of antimicrobial positivity caused by polyphosphates can be reduced by controlling the amounts of added tripolyphosphate and pyrophosphate.

Key words：polyphosphate；tripolyphosphate；pyrophosphate；antimicrobial；microbiologic method

多聚磷酸鹽類添加劑作為保水劑和品質(zhì)改良劑在水產(chǎn)品加工中被廣泛應(yīng)用，具有保持水分、改善口感色澤、增重等作用[1-2]。多聚磷酸鹽會(huì)促進(jìn)血液凝結(jié)，其降解產(chǎn)物磷酸鹽也會(huì)增大攝入者心腦血管疾病發(fā)生的可能性[3-4]，因此，歐盟等國(guó)對(duì)進(jìn)口蝦仁有限量要求(5g/kg)。另據(jù)研究表明多聚磷酸鹽具有抑菌作用[5-6]，近幾年我國(guó)出口蝦仁多次被通報(bào)抑菌劑超標(biāo)，主要是由添加抑菌劑多聚磷酸鹽所致[7]。因此如何突破歐盟抑菌劑技術(shù)壁壘成為水產(chǎn)出口企業(yè)關(guān)注的新問題。

微生物法的樣品前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，在一定范圍內(nèi)有良好的劑量-抑菌關(guān)系，被廣泛應(yīng)用于抗生素的抑菌效果檢測(cè)[8-10]。枯草芽孢桿菌既對(duì)抗革蘭氏陽性菌藥物敏感，又對(duì)抗革蘭氏陰性菌藥物敏感，同時(shí)還有芽孢的特性，能耐受高溫、干燥和滲透壓的影響，因此具有較好的穩(wěn)定性、安全性，對(duì)環(huán)境及人畜無污染。滕黃微球菌對(duì)多種藥物具有較好的敏感性[11]。此外，不同pH值培養(yǎng)基影響藥物敏感性。因此，本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌和滕黃微球菌作為目標(biāo)敏感菌，通過微生物法研究多聚磷酸鹽主要成分正磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽和焦磷酸鹽在不同pH值培養(yǎng)基上的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、滕黃微球菌(ATCC9341) 中國(guó)藥品生物制品檢定所。

檢測(cè)瓊脂(pH6.0)、檢測(cè)瓊脂(pH7.2)、檢測(cè)瓊脂(pH8.0) 德國(guó)Merker公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京陸橋公司；標(biāo)準(zhǔn)品：正磷酸鹽、三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、三偏磷酸鹽 Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BK-6160培養(yǎng)箱、FISHER-LEGEND MACH1.6R高速冷凍離心機(jī) Thermo公司；MSI渦旋混合儀 德國(guó)IKA公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；Logic A2生物安全柜 美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株處理和平板制備方法

枯草芽孢桿菌懸液制備：將枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物用適量滅菌生理鹽水洗滌菌苔，制成懸液，用吸管將此懸液接種于盛有100mL普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶中，在35～37℃條件下培養(yǎng)，鏡檢芽孢數(shù)達(dá)85%以上停止培養(yǎng)。用40mL滅菌生理鹽水洗下菌苔，制成懸液，65℃水浴加熱30min將菌體殺死，經(jīng)3000r/min離心20min，棄去上清液，如此重復(fù)洗滌芽孢兩次，然后用適量滅菌生理鹽水制成菌懸液。置2～8℃冰箱中保存。

滕黃微球菌懸液制備：取滕黃微球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用適量的滅菌生理鹽水洗滌菌苔，制成懸液，用吸管移至盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基克氏瓶中，26～27℃培養(yǎng)18～24h后，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液。置2～8℃冰箱中保存。

Bs6平板：將枯草芽孢桿菌孢子懸浮液接種至pH6檢測(cè)瓊脂液中，調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)孢子/mL瓊脂。取5mL被接種過的瓊脂液倒在平板上，備用。

Bs7.2平板：將枯草芽孢桿菌孢子懸浮液接種至pH7.2檢測(cè)瓊脂液中，調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)孢子/mL瓊脂。取5mL被接種過的瓊脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷卻，備用。

Bs8平板：將枯草芽孢桿菌孢子懸浮液接種至pH8檢測(cè)瓊脂液中，調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)孢子/mL瓊脂。取5mL被接種過的瓊脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷卻，備用。

MI8平板：將滕黃微球菌孢子懸浮液接種至pH8檢測(cè)瓊脂液中，直至濃度為5×104個(gè)孢子/mL瓊脂。5mL被接種過的瓊脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷卻，備用。

1.3.2 抑菌劑檢測(cè)方法

每一個(gè)樣品準(zhǔn)備Bs6、Bs7.2、Bs8和MI8四個(gè)平板，每一個(gè)平板上放置直徑為6mm的兩張紙片。吸取10μL試劑加在紙片上，在室溫(25℃左右)放置10min，以便使供試樣液能擴(kuò)散至培養(yǎng)基。Bs6、Bs7.2、Bs8平板(30±1)℃培養(yǎng)(20±2)h以及MI8平板(36±1)℃培養(yǎng)(26±2)h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量出現(xiàn)的抑菌圈的寬度。同時(shí)在滕黃色微球菌平板上加紅霉素標(biāo)準(zhǔn)紙片(0.0025μg/片)做陽性對(duì)照，在枯草芽孢桿菌上加卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)紙片(0.05μg/片)做陽性對(duì)照，6mm標(biāo)準(zhǔn)空白紙片加10μL無菌水做陰性對(duì)照。如果抑菌圈的寬度大于2mm則認(rèn)為抑菌劑陽性。如果結(jié)果可疑(同一樣品的檢測(cè)結(jié)果為一個(gè)陽性，另一個(gè)陰性)，實(shí)驗(yàn)必須重復(fù)，如果第二次實(shí)驗(yàn)仍然可疑，則判為陰性。

1.3.3 多聚磷酸鹽各成分抑菌效果檢測(cè)

將正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0g/100mL不同質(zhì)量濃度，根據(jù)抑菌劑檢測(cè)方法分別進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)，以空白作對(duì)照，測(cè)定抑菌圈寬度。

1.3.4 磷酸鹽類質(zhì)量濃度換算為以P2O5計(jì)的方法

三聚磷酸鹽質(zhì)量濃度以P2O5計(jì)的換算公式：M/367.86×141.94×3/2

焦磷酸鹽質(zhì)量濃度以P2O5計(jì)的換算公式：M/265.90×141.94×2/2

式中，M：如質(zhì)量濃度0.2g/100mL，換算為2000mg/kg，M即為2000。

1.3.5 焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽聯(lián)合作用對(duì)抑菌效果的影響

對(duì)三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽進(jìn)行兩因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究其對(duì)抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 多聚磷酸鹽各成分抑菌效果檢測(cè)

對(duì)水產(chǎn)品添加劑的單一成分，包括正磷酸鹽、三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽和三偏磷酸鹽，進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)，結(jié)果見表1～4。正磷酸鹽、偏磷酸鹽產(chǎn)生抑菌效果時(shí)的質(zhì)量濃度太高，在實(shí)際加工中不用。因此，蝦仁產(chǎn)生抑菌劑是多聚磷酸鹽中三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果產(chǎn)生的。在三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3g/100mL時(shí)，產(chǎn)生抑菌圈寬度為2.0mm。

表1 不同質(zhì)量濃度正磷酸鹽產(chǎn)生的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity of orthophosphate at different concentrations mm

表2 不同質(zhì)量濃度三聚磷酸鹽產(chǎn)生的抑菌效果Table 2 Antimicrobial activity of tripolyphosphate at different concentrations mm

表3 不同質(zhì)量濃度焦磷酸鹽產(chǎn)生的抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of pyrophosphate at different concentrations mm

表4 不同質(zhì)量濃度三偏磷酸鹽產(chǎn)生的抑菌效果Table 4 Antimicrobial activity of trimetaphosphate at different concentrations mm

2.2 三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果臨界測(cè)試

通過對(duì)三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度分別為0.2g/100mL和0.3g/100mL時(shí)，在Bs7.2平板上產(chǎn)生寬度為2mm的抑菌圈。因此選擇Bs7.2平板研究三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果臨界測(cè)試、結(jié)果見表5。三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0.2g/100mL和0.3g/100mL時(shí)，均可產(chǎn)生2.0mm抑菌圈。

表5 三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果臨界測(cè)試Table 5 Critical antimicrobial concentrations of pyrophosphate and trimetaphosphate mm

出口蝦仁多聚磷酸鹽的檢測(cè)結(jié)果是以五氧化二磷含量計(jì)算的。因此，本研究將三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果臨界質(zhì)量濃度換算為以五氧化二磷計(jì)。這兩種鹽的抑菌效果臨界值以P2O5計(jì)分別為1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。

2.3 焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽交互作用對(duì)抑菌效果的影響

不同焦磷酸鹽和三聚磷酸質(zhì)量鹽濃度有不同的抑菌效果，為了分析兩種磷酸鹽不同質(zhì)量濃度配比對(duì)抑菌效果的影響，選取了3個(gè)不同質(zhì)量濃度在Bs7.2平板上進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素水平見表6。

表6 正交試驗(yàn)因素水平表Table 6 Factor and levels in the orthogonal array design

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal array design arrangement and experimental results

從表7可以得出，三聚磷酸鹽的質(zhì)量濃度為0.4g/100mL、焦磷酸鹽的質(zhì)量濃度為0.6g/100mL時(shí)，其抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈寬度為5.6mm；三聚磷酸鹽的質(zhì)量濃度為0.2 g/100mL、焦磷酸鹽的質(zhì)量濃度為0.3g/100mL時(shí)，抑菌圈寬度為2.3mm，即兩者同時(shí)作用時(shí)，抑菌圈并非會(huì)成倍增長(zhǎng)，而是在單獨(dú)作用的基礎(chǔ)上有所增強(qiáng)；三聚磷酸鹽質(zhì)量濃度為0.2g/100mL，焦磷酸質(zhì)量濃度為0.15g/100mL時(shí)，產(chǎn)生2.0mm抑菌圈；三聚磷酸鹽質(zhì)量濃度為0.1g/100mL、焦磷酸鹽質(zhì)量濃度為0.3g/100mL時(shí)，產(chǎn)生2.2mm抑菌圈，表明當(dāng)二者有一種質(zhì)量濃度達(dá)到臨界濃度，就能產(chǎn)生抑菌陽性作用。

3 結(jié) 論

目前，對(duì)于多聚磷酸鹽已有較多的研究，但國(guó)內(nèi)的研究大多是基于其對(duì)肉品質(zhì)的改善[2,12]或用離子色譜法測(cè)定含量[13-14]，國(guó)外已有針對(duì)多聚磷酸鹽對(duì)金黃色葡萄球菌[5]以及蠟狀芽孢桿菌[6]抑菌效果的研究，但沒見多聚磷酸鹽對(duì)枯草芽孢桿菌以及滕黃微球菌抑菌作用的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用了兩種微生物法常用菌種，并考慮到培養(yǎng)基pH值對(duì)抑菌效果的影響，采用了四平板法對(duì)多聚磷酸鹽抑菌效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，Bs7.2平板上磷酸鹽的抑菌效果最為明顯，其他平板上只有三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽在高質(zhì)量濃度情況下才表現(xiàn)出抑菌作用。

對(duì)多聚磷酸鹽的4種主要成分抑菌效果研究發(fā)現(xiàn)，主要抑菌成分為三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽。通過進(jìn)一步研究表明，在質(zhì)量濃度分別為0.2g/100mL和 0.3g/100mL時(shí)，產(chǎn)生2mm抑菌圈，即抑菌效果呈陽性。表明當(dāng)二者有一種質(zhì)量濃度達(dá)到臨界濃度，就能產(chǎn)生抑菌劑陽性作用。將三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽抑菌效果臨界質(zhì)量濃度換算為以五氧化二磷計(jì)分別為1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。因此對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行多聚磷酸鹽理化檢測(cè)后，當(dāng)三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽含量超過臨界數(shù)值時(shí)，存在抑菌劑超標(biāo)潛在風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)水產(chǎn)品檢測(cè)出抑菌劑陽性時(shí)，三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽含量可能偏高，則存在多聚磷酸鹽含量超標(biāo)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用微生物法對(duì)多聚磷酸鹽的抑菌效果檢驗(yàn)，操作簡(jiǎn)便、具有很大的廣泛性和可操作性，有助于突破國(guó)外技術(shù)壁壘。

[1] 李苗云, 張秋會(huì), 柳艷霞, 等. 不同磷酸鹽對(duì)肉品保水性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 42(4):439-442.

[2] 馮慧, 薛長(zhǎng)湖, 高瑞昌, 等. 多聚磷酸鹽在冷凍羅非魚肉中的降解及其對(duì)魚肉品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(9):239-241; 265.

[3] SMITH S A, MUTCH N J, BASKAR D, et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2006, 103(4):903-908.

[4] SMITH S A, MORRISSEY H. Polyphosphate enhances fibrin clot structure[J]. Blood, 2008, 112(7):2810-2816.

[5] JEN C M, SHELEF L A. Factors affecting sensitivity ofStaphylococcus aureus196E to polyphosphates[J]. Appl Environ Microbiol, 1986, 52(4):842-846.

[6] MAIER S K, SCHERER S, LOESSNER M J. Long-chain polyphosphate causes cell lysis and inhibitsBacillus cereusseptum formation, which is dependent on divalent cations[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65:3942-3949.

[7] 沈飚. 一起冷凍水產(chǎn)品中超量使用抑菌劑的調(diào)查研究[J]. 公共衛(wèi)生雜志, 2006, 22(增刊1):122.

[8] HORIE M, KOBAYASHI H, ISHII R, et al. Simple and rapid microbiological method for determination of residual antibacterials in meat[J].Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2008, 49(3):168-176.

[9] GILBERTSON T J, MEJEUR R L, YEIN F S, et al. Modified microbiological method for the screening of antibiotics in milk[J]. J Dairy Sci,1995, 78(5):1032-1038.

[10] KUSANO T, KANDA M, KAMATA K, et al. Microbiological method for the detection of antibiotic residues in meat using mixed-mode, reverse-phase and cation-exchange cartridge[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi,2004, 45(4):191-196.

[11] 熊業(yè)華, 謝長(zhǎng)清. 抗菌藥物殘留微生物學(xué)快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[C]//“食品安全質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)”試刊論文集, 2008-06-30:5-9; 12.

[12] 胡坤, 何志波, 何國(guó)富. 復(fù)合多聚磷酸鹽肉丸品質(zhì)改良劑的研制[J].肉類工業(yè), 2008(3):33-36.

[13] 崔晗, 陳溪, 黃大亮, 等. 離子色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中的檸檬酸鹽和多聚磷酸鹽[J]. 分析試驗(yàn)室, 2009, 28(B5):67-69.

[14] 王雪, 陳笑梅, 朱巖. 離子色譜法測(cè)定冷凍水產(chǎn)品中的多聚磷酸鹽[J]. 分析試驗(yàn)室, 2008, 27(7):82-84.

Antimicrobial Effect of Polyphosphate Additives in Fishery Product

SHEN Biao1，HU Xing-juan1，XU Jun-hui1，BEI Wen-lian1，WU Zu-fang2
(1. Zhoushan Eentry-Exit Inspection and Quaratine Burea, Zhoushan 316000, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

TS254.7

A

1002-6630(2010)21-0054-04

2010-02-22

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)(2008C12076)

沈飚(1967—)，男，高級(jí)工程師，本科，主要從事微生物與食品安全研究。E-mail：sb@zs.ziq.gov.cn