布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及活性測定

姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學藥學院，上海 200240

布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及活性測定

姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學藥學院，上海 200240

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏錐蟲蛋白合成過程中的一類重要酶，以其為靶點的抑制劑可能發展成為新一代的抗錐蟲藥物，但此前并沒有分離錐蟲苯丙氨酸-tRNA合成酶的報道。本研究用大腸桿菌成功克隆表達并純化了布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶并進行了活性測定。首先通過PCR方法從布氏錐蟲細胞基因組中分別擴增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亞基、β亞基的基因，依次克隆入pCOLADuet共表達載體，然后在大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中進行了成功表達，并采用Ni-Bind親和層析對其進行了純化，最后用免疫印跡進行了鑒定。此外還采用放射性同位素方法進行了酶活性測定，這為下一步進行布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的設計和體外篩選奠定了良好的基礎。

布氏錐蟲，苯丙氨酰-tRNA合成酶，原核表達，純化，酶活測定

Abstract:Phenylalanyl-tRNA synthetase is a key enzyme for protein synthesis in Trypanosoma.Its validation as an inhibition target will enable the development of a new generation of anti-Trypanosoma drugs.However, little is known about the isolation of the Trypanosoma Phenylalanyl-tRNA synthetase.Here we report the cloning, expression, purification and activity assay of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei in Escherichia coli host.We co-cloned the α-subunit and β-subunit of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei genomic DNA into the co-expression vector pCOLADuet.We successfully expressed the Trypanosoma brucei Phenylalanyl-tRNA synthetase in E.coli host, purified the whole enzyme by Ni-Hind affinity column and verified it by Western blotting.In addition, we tested its enzymatic activity by isotope labeling.The whole work laid a solid foundation for in vitro the screening and optimization of Trypanosoma brucei phenylalanyl-tRNA synthetase inhibitors.

Keywords:Trypanosoma brucei, phenylalanyl-tRNA synthetase, prokaryotic expression, purification, enzyme activity assay

布氏錐蟲是一種在撒哈拉以南非洲地區所特有的寄生蟲，當侵入寄主后會引起非洲錐蟲病或昏睡病，每年都會引起非常嚴重的死亡率和和令人震驚的社會和經濟后果[1]。目前市場上存在的治療熱帶寄生蟲的藥物多數有藥物毒性、抗藥性等導致的療效有限問題；由于這些疾病主要影響世界貧困地區的貧困人口，長久以來很難成為醫藥企業關注的目標市場。但如今的籌資情況發生了很大的變化，世界衛生組織(WHO)瘧疾新藥研發(DNDi)等機構以及一些慈善機構已經高度重視熱帶寄生蟲病，并且加大了在這方面的支持[2-3]。……