靶向HIV-1 pol的高效人工miRNA的構建與體外抗病毒能力評價

程通，張濤，張雅麗，魏麗華，夏德鎮，王穎彬，張軍，夏寧邵

廈門大學生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361005

靶向HIV-1 pol的高效人工miRNA的構建與體外抗病毒能力評價

程通，張濤，張雅麗，魏麗華，夏德鎮，王穎彬，張軍，夏寧邵

廈門大學生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361005

RNAi技術在抗HIV-1治療研究中已顯示出巨大潛力，獲得可高效特異抑制HIV-1的RNAi元件是進行相關研究的重要基礎。miRNA在抑制和表達方式上相比siRNA具有更多的優勢。本研究即探討構建可高效特異靶向HIV-1的人工miRNA元件。選擇以保守性較好的HIV-1 pol基因為靶區篩選高效保守的RNAi序列，設計了16個可靶向pol區高保守區段的RNAi靶點，構建表達載體與HIV-1感染性克隆進行共轉染抑制實驗，篩選顯示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特點。以天然miR-30a為基礎骨架構建了靶向pol1026靶點的人工miRNA元件，通過與HIV-1感染性克隆質粒的共轉染抑制實驗驗證獲得了可有效抑制HIV-1表達的人工miRNA元件(miR-1026E)。通過與攜帶靶序列的報告質粒的共轉染實驗證明miR-1026E具有良好的靶點特異性。本研究進一步構建了攜帶miR-1026E表達元件的重組慢病毒，轉導MT-4細胞并對轉導后細胞進行克隆化篩選，獲得穩定整合miR-1026E表達元件的MT-4-miR1026E細胞克隆，該細胞在體外攻毒實驗中可高效抑制HIV-1的復制，具有顯著的抑制HIV-1的能力。同時應用實時RT-PCR方法檢測顯示，miR-1026E在細胞中不會影響內源性代表miRNA(miR-181與miR-16)的表達水平和干擾素效應相關基因stat1的表達水平，具有良好的特異性?！?br>