6-羥基-多溴聯苯醚 47對 A549細胞抗氧化系統的影響

趙金玉, 鐘玉芳, 王藝陪, 王楊君, 安 靜, 盛國英, 傅家謨

(上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所,上海 200444)

6-羥基-多溴聯苯醚 47對 A549細胞抗氧化系統的影響

趙金玉, 鐘玉芳, 王藝陪, 王楊君, 安 靜, 盛國英, 傅家謨

(上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所,上海 200444)

多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一類具有內分泌干擾和神經毒性的持久性有機污染物,但對其代謝產物的毒性研究還較少.從細胞毒性和氧化應激的角度,探討 2,2′,4,4′-四溴聯苯醚 (2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)的羥基代謝物 6-羥基 -多溴聯苯醚 47(6-hydroxylated-2,2′,4,4′-tetrapolybrominated diphenyl ethers,6-OH-BDE47)對人肺癌細胞系 A549的作用.研究結果發現,6-OH-BDE47對 A549細胞具有明顯的細胞毒性,隨著染毒劑量增加和時間延長,A549細胞存活率逐漸下降.急性染毒實驗證實,6-OH-BDE47對 A 549細胞的氧化應激系統有嚴重的影響.當細胞培養體系中 6-OH-BDE47濃度≥0.5μmol/L時,24 h急性暴露能誘導A549細胞的總超氧化物歧化酶 (total superoxide dismutase,T-SOD)活力升高 1.03倍以上;而 6-OH-BDE47濃度≥2.0 μmol/L時,還原性谷胱甘肽 (reduced the glutathione,GSH)含量減少 71.2%.由此可見,6-OH-BDE47有一定的細胞毒性,能刺激A549細胞發生氧化應激,誘導抗氧化酶升高和內源性還原劑耗竭.

多溴聯苯醚;持久性有機污染物;氧化應激;多溴聯苯醚 47

Abstract:Polybrominated diphenyl ethers(PBDEs),a classof persistentorganic pollutants,wereproved to be endocrine disrup tors and neurotoxic agents.However,there are few reports about the toxic effectsof their hydroxylated metabolites.Our objectivewas to investigate the cytotoxicity of 6-hydroxylated-2,2′,4,4′-tetrapolybrominated diphenyl ethers(6-OH-BDE47)and its effectson anti-oxidative systems in A549 cells after acute exposure.The results show that6-OH-BDE47 hasobviouscytotoxicity,and the A549 cell survival gradually decrease after exposure in a dose-and time-dependent manner. Acute exposure experiment confirmed that the oxidative stress system of A549 cells was seriously impaired by 6-OHBDE47.When the final concentration of 6-OH-BDE47 in culture medium was higher than 0.5μmol/L,the total superoxide dismutase(T-SOD)content in treatment group cells increased by 1.03 times compared to the control group cells;and≥2.0μmol/L of 6-OH-BDE47 reduced the glutathione content by 71.2%.These results suggest that 6-OH-BDE47 has certain cytotoxicity on A 549 cells and can impair oxidative stress responses as evidenced by increased SOD activity and decreased GSH.

Key words:polybrominated diphenyl ethers;persistent organic pollutants;oxidative stress;BDE47

多溴聯苯醚 (polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一類廣泛應用于電子、化工、建材等領域的溴代阻燃劑,具有環境穩定性和親脂性等特征,容易在環境中積累并通過食物鏈富集.隨著 PBDEs應用的增長,其對生態環境的危害也日益凸顯.有研究預測,在未來的 15～30年內,PBDEs將成為主要的環境持久性有機污染物.目前,在許多環境介質和生物體內均可以檢測到 PBDEs的存在,如大氣、水、沉積物、魚類、淡水貝類、母乳等[1-5],人體樣品中以BDE47,BDE99,BDE153和 BDE183為主要同系物[6-7].PBDEs有兩種類型的代謝產物,即羥基化PBDEs和甲氧基 PBDEs,在人體內也檢測到了這兩類代謝物[8].研究表明,PBDEs具有內分泌干擾效應、神經發育毒性等特性[9-11].目前,對 PBDEs代謝產物的毒性研究還較少,本實驗選用 BDE-47的羥基代謝物 6-OH-BDE47,觀察其對人肺癌細胞 A549的細胞毒性以及氧化應激相關的超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽 GSH的影響.

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

人肺癌細胞系 A 549,購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫;噻唑藍 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT),購自上海前塵生物公司;二甲基亞砜 (DMSO),美國 Amresco公司生產;超氧化物歧化酶 SOD檢測試劑盒和谷胱甘肽 GSH檢測試劑盒,購自南京建成生物工程公司;其余試劑為國產分析純.

1.2 儀器

實驗儀器有 Thermo Labsystems MK3酶標儀、Thermo全波長熒光 /比色掃描讀數儀、國產恒溫水浴鍋等.

2 實驗方法

2.1 實驗分組與染毒處理

本實驗設 1個溶劑對照組和 3個劑量 6-OHBDE47染毒組.溶劑對照組用體積分數為 0.1%的DMSO處理,6-OH-BDE47溶于 DMSO,分 0.1,0.5和 2.0μmol/L 3個濃度組.

2.2 測定細胞存活率的M TT試驗

MTT試驗是通過測定活細胞代謝噻唑藍的藍紫色產物的量來反映細胞存活率或細胞活力的細胞毒性檢測方法,并通過該試驗篩選受試物的作用時間.稱取一定量的MTT溶于磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline,PBS)中 ,配成 5 mg/mL MTT/PBS溶液,0.22μm濾膜過濾后于 4℃避光保存.取對數生長期的 A549細胞接種于 4塊 96孔培養板中,每孔2×103個細胞,每組 5個平行樣.培養過夜后換無血清培養基,分別加入體積分數為 0.1%的 DMSO,終濃度分別為 0.1,0.5和 2.0μmol/L的 6-OH-BDE47(DMSO濃度控制在 0.1%).分別染毒 6,24,48,72 h后加入終濃度 0.5 mg/mL的MTT,37℃孵育4 h,吸去上清后加 DMSO溶解,用酶標儀于 492 nm處測其光密度.

2.3 SOD活力檢測

SOD是細胞啟動氧化應激效應和清除超氧陰離子的重要角色.本實驗采用黃嘌呤氧化酶法,通過測定超氧陰離子 O2-氧化羥胺生成的亞硝酸鹽含量可反映 SOD的活力.高等動物細胞內有兩種 SOD,即銅鋅 SOD(CuZn-SOD)和錳 SOD(Mn-SOD).本實驗將對細胞內總 SOD(T-SOD)和分型 SOD分別進行檢測,以觀察不同亞型 SOD在 6-OH-BDE47氧化應激效應中的作用.取對數生長期的 A549細胞,接種于 75 mL細胞培養瓶,每瓶約 1×106個細胞.細胞培養過夜后按上述分組染毒,每組 3個平行樣,根據MTT試驗篩選的染毒時間,染毒 24 h后收獲細胞,超聲破碎,其余具體操作步驟按說明書進行.SOD活力 (U/mg pro)=(OD對照管-OD測定管)×反應總體積 /(OD對照管×50% ×取樣量 ×待測樣本蛋白含量).

2.4 GSH含量檢測

GSH是抗氧化系統中含量豐富的抗氧化劑,測定其含量可反映細胞抗氧化水平.利用二硫代二硝基苯甲酸與 GSH上的巰基反應,生成的黃色化合物可進行比色定量.取對數生長期的 A549細胞,接種于 75 mL細胞培養瓶,每瓶約 1×106個細胞.細胞培養過夜后按上述分組染毒,24 h后收獲細胞,超聲破碎,其余具體操作步驟按說明書進行.GSH含量(mg/g pro)=(OD測定管-OD空白管) ×標準管 GSH濃度 ×GSH分子量 307/[(OD標準管-OD空白管)×待測樣本蛋白含量].

2.5 Bradford法定量蛋白

參照文獻[12]中的方法進行.

2.6 統計學方法

本研究采用 SPSS10.0進行 One-way ANOVA分析,均數以 x-±s表示.

3 實驗結果

3.1 6-OH-BDE47對 A549細胞存活率的影響

由圖1可見,A 549細胞的存活率與 6-OHBDE47之間存在著明顯的劑量和時間效應關系.低濃度 (0.1μmol/L)6-OH-BDE47作用 24 h后,細胞仍保持 90%的存活率 (后續實驗選擇 24 h作為染毒時間),72 h后降至 80%;而高濃度 (2.0μmol/L)6-OH-BDE47作用 6 h后,細胞的存活率下降至 80%左右,72 h后只有 30%的細胞存活.

圖1 6-OH-BDE47對 A549細胞存活率的影響Fig.1 Survival rate of A549 cells after treatment by 6-OH-BDE47

3.2 6-OH-BDE47對 A 549 SOD活力的影響

由表 1可見,0.1μmol/L組與對照組細胞 TSOD活力無統計學差異,而 0.5μmol/L組和 2.0 μmol/L組細胞的 T-SOD活力與對照組相比分別升高了 1.03倍和 1.15倍,差異有統計學意義.Mn-SOD活力在各染毒組均表現出升高的趨勢,0.1μmol/L組升高 47.1%,0.5μmol/L組升高 2倍,2.0μmol/L處理組升高2.96倍,但僅2.0μmol/L組與對照組的差異有統計學意義.

表 1 不同濃度 6-OH-BDE47對 A549總 SOD活力和分型SOD活力的影響Table 1 Changes of T-SOD,CuZn-SOD and M n-SOD activities in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47(U/m g pro,x—±s,n=3)

3.3 6-OH-BDE47對 A549 GSH含量的影響

由表 2可見,隨著染毒濃度的升高,各處理組GSH含量逐漸下降,0.1,0.5和 2.0μmol/L組細胞中GSH含量分別下降 21.6%,34.8%和 71.2%,其中2.0μmol/L組與對照組的差異有統計學意義.

表 2 不同濃度 6-OH-BDE47對 A549 GSH含量的影響Table 2 Changes of GSH concentration in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47

表 2 不同濃度 6-OH-BDE47對 A549 GSH含量的影響Table 2 Changes of GSH concentration in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47

注:與對照組相比,＊P<0.05

組別 對照組 0.1μmol/L組0.5μmol/L組2.0μmol/L組GSH含量 8.06±0.36 6.31±0.46 5.26±2.94 2.32±1.90＊

4 結 束 語

在生理狀態下,細胞會產生一定量的自由基,同時細胞內的抗氧化系統維持在一定水平以清除這些自由基,避免其與核酸、蛋白等生物大分子反應而損傷細胞.在外來刺激作用下,細胞會產生大量自由基,此時抗氧化系統也會被調動起來,其中 SOD作為一種金屬酶可催化超氧陰離子自由基O2-發生歧化反應,從而清除氧自由基,隨著 O2-的產生量增加,SOD會相應大量表達.GSH作為抗氧化系統中含量豐富的抗氧化劑,參與許多氧化物質如 H2O2,ROOH等的解毒過程.從本工作的研究結果可見,在高于 0.5μmol/L 6-OH-BDE47作用下,A549細胞SOD活力可增加 2～3倍,這說明 6-OH-BDE47可能使細胞產生大量O2-,從而誘導 SOD的大量表達,且主要是Mn-SOD含量升高;同時,2.0μmol/L 6-OHBDE47使細胞產生了相當數量的 H2O2,ROOH等自由基,促進 GSH的消耗而使其含量下降.氧化應激效應可能導致細胞的損傷甚至死亡,本研究觀察到隨著 6-OH-BDE47劑量的增加,細胞存活率有逐漸下降的趨勢,推測與細胞氧化應激水平有一定關系,但其具體機理有待進一步研究.

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(編輯:劉志強)

Effects of 6-hydroxylated Polybrom inated D iphenyl Ether s-47 on Anti-Oxidative System s of A549 Cells

ZHAO Jin-yu, ZHONG Yu-fang, WANG Yi-pei, WANG Yang-jun,
AN Jing, SHENG Guo-ying, FU Jia-mo(Institute of Environmental Pollution and Health,School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China)

R 994

A

1007-2861(2010)03-0302-04

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.03.017

2009-02-13

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(2008CB418205);上海市重點學科建設資助項目(S30109)

安 靜 (1976～),女,副研究員,博士,研究方向為環境毒理學.E-mail:peace74839@shu.edu.cn