輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率

鄭嫻嫻，何金生，付遠(yuǎn)輝，徐少華，謝燦，石長信，張梅，王小波，洪濤,4

1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率

鄭嫻嫻1,2，何金生1,2，付遠(yuǎn)輝2，徐少華2，謝燦1，石長信3，張梅1，王小波1,2，洪濤2,4

1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

構(gòu)建可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)，并完成大量制備、純化和體外表達(dá)鑒定。熒光顯微鏡證實(shí)HDAd/EGFP可表達(dá)，電鏡下觀察到經(jīng) CsCl純化后的腺病毒的典型形態(tài)。分光光度計(jì)法測定病毒的濃度為 4.0×1012顆粒數(shù)(Virus particle，vp)/mL。與可表達(dá)EGFP的第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector，F(xiàn)GAd)FGAd/EGFP進(jìn)行了體外感染和轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的比較研究，分別用約2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測EGFP的表達(dá)情況。通過相同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞儀分析EGFP的表達(dá)情況，可見HDAd/EGFP感染早期的A549細(xì)胞較 FGAd/EGFP有更高的熒光表達(dá)率及更高的表達(dá)強(qiáng)度，顯示 HDAd載體具有轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)高表達(dá)的特性，是一種更有價(jià)值的疫苗載體。

輔助病毒依賴型腺病毒載體，第一代腺病毒載體，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)基因表達(dá)

Abstract:To investigate the transgenic expressing efficacy of helper-dependent adenoviral vector(HDAd)in vitro, we constructed a HDAd encoding enhanced green fluorescent protein(EGFP), denominated as HDAd/EGFP, performed large scale preparation and purification, and then identified the purified HDAd/EGFP under fluorescent microscope and electron microscope.After the concentration of HDAd/EGFP was determined by spectrophotometer, the transgenic expression efficiency of HDAd/EGFP was compared with first generation adenoviral vector encoding EGFP(FGAd/EGFP)in vitro.Therefore, we infected A549 cells with 2 000 virus particles(vp)per cell by HDAd/EGFP and FGAd/EGFP respectively and analyzed EGFP expressing level by flow cytometry.Consequently, the fluorescent expression rate and fluorescent intensity ofEGFP were higher in early infected A549 cells by HDAd/EGFP than by FGAd/EGFP.HDAd, capable of expressing transgene instantly and efficiently in vitro, is a potential vaccine vector.

Keywords:helper-dependent adenoviral vector(HDAd), first generation adenoviral vector(FGAd), enhanced green fluorescent protein(EGFP), transgenic expression

輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)是在第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector，F(xiàn)GAd)基礎(chǔ)上研制的一種全缺失的腺病毒載體[1]，僅含有腺病毒復(fù)制信號(ITRs)和包裝信號(Ψ)，需要輔助病毒為其提供包裝所需的所有蛋白。……