絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1啟動子區的克隆和乙醇脅迫下啟動子活性的變化

林貝，趙心清，張秋美，馬黎明，白鳳武

1 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024 2 北京化工大學北方學院理工院，廊坊 065201

絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1啟動子區的克隆和乙醇脅迫下啟動子活性的變化

林貝1,2，趙心清1，張秋美1，馬黎明1，白鳳武1

1 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024 2 北京化工大學北方學院理工院，廊坊 065201

提高生物能源生產菌株對各種脅迫因素的耐受性對于提高生產過程的經濟性和高效生產生物能源具有重要的意義。對釀酒酵母乙醇耐性的分子機制的研究，可揭示影響其耐受性的關鍵基因，并通過代謝工程操作定向提高酵母菌的乙醇耐受性，從而提高燃料乙醇的生產效率。海藻糖對酵母菌在多種環境脅迫下的細胞活性具有保護作用，但其對乙醇耐性分子機制的研究還不夠深入。克隆了自絮凝酵母Saccharomyces cerevisiaeflo的海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1的啟動子區域，利用pYES2.0載體骨架，構建了PTPS1啟動綠色熒光蛋白EGFP標記基因的報告載體，并轉化釀酒酵母ATCC4126。對酵母轉化子在含有7%和10%乙醇的生長培養基中的EGFP的表達情況進行相對熒光定量分析，發現PTPS1活性在7%乙醇存在下受到強烈誘導。EGFP表達量對高溫和高糖脅迫無明顯差別，顯示了TPS1啟動子對乙醇濃度的特異響應。研究結果表明，絮凝酵母海藻糖的合成是對乙醇脅迫的保護性反應。

自絮凝酵母，海藻糖-6-磷酸合成酶TPS1，綠色熒光蛋白，報告載體，乙醇脅迫

Abstract:Improving stress tolerance of the microbial producers is of great importance for the process economy and efficiency of bioenergy production.Key genes influencing ethanol tolerance of brewing yeast can be revealed by studies on the molecular mechanisms which can lead to the further metabolic engineering manipulations for the improvement of ethanol tolerance and ethanol productivity.Trahalose shows protective effect on the cell viability of yeast against multiple environmental stress factors, however,further research is needed for the exploration of the underlying molecular mechanisms.In this study, the promoter region of the trehalose-6-phosphate synthase geneTPS1was cloned from the self-flocculating yeastSaccharomyces cerevisiae flo,and a reporterplasmid based on the expression vector pYES2.0 on which the green fluorescence protein EGFP was directed by theTPS1promoter was constructed and transformed to industrial yeast strainSaccharomyces cerevisiaeATCC4126.Analysis of the EGFP expression of the yeast transformants in presence of 7% and 10% ethanol revealed that thePTPS1activity was strongly induced by 7% ethanol,showing specific response to ethanol stress.The results of this study indicate that trehalose biosynthesis in self-flocculating yeast is a protective response against ethanol stress.

Keywords:self-flocculating yeast, trehalose-6-phosphate synthase, green fluorescence protein, report vector, ethanol stress

提高生物能源生產菌株對各種脅迫因素的耐受性對于高效生產生物能源具有重要的意義，這些脅迫因素包括高溫、高滲透壓、低pH以及各種毒性代謝物或原料水解產物等。對于利用釀酒酵母生產燃料乙醇，尤其是超高濃度乙醇發酵的過程，酵母菌對高濃度乙醇的耐受性是提高發酵終點乙醇濃度的重要前提，但是目前為止對影響酵母菌乙醇耐受性的因素還不夠深入。研究酵母菌乙醇耐性的分子機制，有助于揭示影響其耐受性的關鍵基因，并通過代謝工程操作定向提高酵母菌的乙醇耐受性，從而提高燃料乙醇的生產效率[1]。

海藻糖對酵母菌在多種環境脅迫條件下的細胞活性具有保護作用，這些脅迫因素包括乙醇沖擊、熱沖擊、冷凍、氧化脅迫等[2-4]。與海藻糖合成相關的基因包括TPS1(海藻糖-6-磷酸合成酶)、TPS2(海藻糖-6-磷酸酶)和TSL1/TPS3(海藻糖-6-磷酸合成酶的調節亞基)，其中TPS1負責催化海藻糖合成的第一步反應，對海藻糖的合成具有重要作用[5]。各國學者對于海藻糖在不同酵母中的抗逆境脅迫作用進行了大量研究，得到的結論卻不完全一致，如對釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeXQ1的研究發現，海藻糖在熱脅迫下明顯積累，但在乙醇和高滲脅迫下其含量沒有明顯變化[6]，而對酵母Saccharomycopsis fibuligera的研究表明，乙醇的脅迫對海藻糖的合成沒有影響[7]。近期有學者對S.cerevisiaeBY4742的研究發現，海藻糖對致死乙醇濃度的脅迫有保護作用，而對半致死濃度的乙醇脅迫沒有作用[8]，這些研究結果提示了海藻糖對釀酒酵母的脅迫保護作用可能與菌種的遺傳背景和乙醇脅迫的程度有關。

利用啟動子構建報告載體可通過報告基因的表達檢測外界環境對啟動子活性的影響。Karreman等構建了GFP報告基因表達載體，利用熱擊蛋白基因Hsp12啟動子驅動GFP的表達，結果證明該啟動子可以響應乙醇、高溫、高滲透壓等多種脅迫環境[9]。本實驗室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生化機理研究表明，不同絮凝顆粒大小的絮凝酵母群體的海藻糖合成具有明顯差別，其乙醇耐受性也有所差別，提示了海藻糖的生物合成與乙醇耐受性的關系。本文通過構建基于綠色熒光蛋白的報告載體進一步研究了海藻糖合成酶基因TPS1在不同濃度乙醇脅迫條件下的反應，發現TPS1啟動子活性受一定乙醇濃度的誘導，進一步證明了海藻糖的生物合成與絮凝酵母乙醇耐受性的關系，為深入研究絮凝酵母乙醇耐性的分子機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 微生物菌種和培養基

絮凝酵母Saccharomyces cerevisiaeflo以及釀酒酵母S.cerevisiaeATCC4126為本實驗室保存。

斜面培養基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 4，蛋白胨 3；

生長培養基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 4，蛋白胨 3。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母TPS1啟動子報告載體的構建

pGEX-2T-EGFP質粒(大連理工大學李文利老師惠贈)含有EGFP基因片段，利用BamH I/EcoR I雙酶切pYES2.0質粒和pGEX-2T-EGFP質粒，獲得質粒 pQZ01。按照參考文獻[10]中的方法提取絮凝酵母基因組 DNA作為模板，利用自行設計的引物TPS1-F(5′-GGAGGAACCGGT AGAGGACGGTTG CTGAA-3′)和 TPS1-R(5′-ATCGGTACC GATTGTC ACGGGAAGCC-3′)擴增TPS1啟動子區，引物兩端分別引入AgeI和KpnI酶切位點，PCR產物連接pQZ01，得到質粒pQZ02。由于釀酒酵母ATCC4126不是URA缺陷型，因此將pQZ02中的URA基因用EcoR I和NotI切除，將來自pFA6A-KanMX4的抗性基因盒用同樣2種酶消化，得到質粒pQZ03。該質粒含有G418抗性基因用于酵母轉化子的選擇，并含有在TPS1啟動子引導下的EGFP基因，因此可通過檢測EGFP的表達來獲得TPS1啟動子對外界環境的響應情況。

1.2.2 報告載體的轉化和轉化子的驗證

報告載體利用電擊法轉化工業釀酒酵母菌株S.cerevisiaeATCC4126，轉化子的篩選利用G418的抗性，濃度為300 μg/mL。將抗性平板上長出的轉化子提取質粒，并轉化大腸桿菌E.coliXL1-Blue，將獲得的大腸桿菌轉化子提取質粒，以自行設計的引物KanF(5′-ATGCGCGCGCGCGCCAGATCTGTTTA GC-3′)和KanR(5′-GCGAGCTCAGCTCGTTTTC GACACTGGA-3′)擴增Kan抗性基因，并通過EcoR I和NotI雙酶切質粒進一步驗證。

1.2.3 報告載體轉化子的熒光檢測

熒光相對定量通過流式細胞儀進行(FACSCantoTM，美國DB公司)。挑取單個釀酒酵母4126轉化子，接種于5 mL含有100 μg/mL G418的YPD培養基中，160 r/min、30℃振蕩培養24 h，取其中的200 μL接種于50 mL含有100 μg/mL G418的YPD培養基中，30℃振蕩培養至菌體進入對數前期，OD600約為0.5。取4瓶44 mL的上述對數期細胞，分別向培養基中加入0、1、3.5、6 mL無水乙醇，為控制各實驗組保持相同的體積，最后用無菌水補至總體積50 mL，得到乙醇終濃度分別為0(對照組)、2%、7%、12%的培養基，于160 r/min、30℃振蕩培養，分別在 0、20、40、60、90、180、360、1 320 min取樣測其OD值，同時取樣1 mL，8 000 r/min離心2 min，用蒸餾水洗滌2次，最后將樣品稀釋至細胞濃度小于106/mL，利用流式細胞儀對GFP進行熒光定量分析。

2 結果與討論

2.1 絮凝酵母TPS1啟動子區的克隆和序列分析

利用釀酒酵母S288c的TPS1啟動子區序列設計引物，以絮凝酵母的基因組序列為模板，擴增出了預期大小的片段。對該擴增片段進行測序，并與模式菌株 S288c的序列進行比對分析發現，絮凝酵母TPS1啟動子區除了有個別堿基存在差異，序列中部還多了一段21 bp的插入序列(圖1)，是一個新的啟動子，該啟動子序列已登錄 GenBank(登錄號FJ536256)。

圖1 絮凝酵母TPS1啟動子區(PTPS1-F)與S288cTPS1啟動子區(PTPS1-S288)差異序列的同源比對Fig.1 Alignment of the differential sequence of the promoter region ofTPS1from self-flocculating yeast and S288c.

2.2 報告載體對乙醇濃度的響應

由于表達載體中，EGFP融合蛋白基因的表達由TPS1啟動子驅動，因此通過EGFP蛋白熒光強度來分析EGFP報告基因的表達水平，可以間接地反應出TPS1啟動子的表達水平。利用7%和12%的乙醇沖擊后，在 7%乙醇的實驗組中綠色熒光蛋白強度明顯提高(圖2A)，顯示了TPS1啟動子的活性在7%乙醇中明顯提高，而且其高活性從60 min開始到 1 320 min(22 h)逐漸提高(圖2A)。7%(V/V)乙醇脅迫時GFP熒光強度達到最高為11 036(A.U)，是無乙醇脅迫時GFP熒光強度的7.3倍。但是由于釀酒酵母抗乙醇脅迫的能力有限，因此隨著乙醇脅迫濃度的進一步加大，即達到 12%(V/V)時，細胞開始死亡，無法啟動GFP基因的表達。本文也嘗試了用 2%(V/V)的乙醇脅迫酵母轉化子，但綠色熒光蛋白的表達與對照沒有明顯差別(數據未顯示)。

由于細胞的生長時期和生理狀態的不均一性，TPS1啟動子活性的誘導在細胞群體中的不同個體可能存在差異。添加 7%乙醇后，有熒光活性的細胞數(陽性率)也明顯提高(圖2B)，說明更多細胞表達了綠色熒光蛋白。熒光顯微鏡觀察發現，在無乙醇脅迫以及12%(V/V)乙醇脅迫時，GFP的表達量均很低，熒光顯微鏡下觀察到的熒光十分微弱，7%(V/V)脅迫后，GFP熒光強度很強(圖3)。以上結果可以充分說明，在乙醇脅迫處理條件下，酵母菌內的TPS1啟動子的表達明顯強于未經脅迫處理的酵母菌，且PTPS1spsc在一定程度上是受乙醇脅迫調控的誘導型啟動子。

圖2 絮凝酵母海藻糖合成酶啟動子在乙醇脅迫下的變化(A)和GFP陽性細胞占有率(B)Fig.2 Promoter activity ofTPS1in presence of different ethanol(A)and ratio of the cells expressing GFP after 180 min(B)under different ethanol concentrations.

圖3 不同乙醇濃度脅迫180 min時GFP表達情況的熒光顯微圖片Fig.3 Cells expressing GFP after ethanol shock treatment under fluorescence microscope.(A)Without ethanol.(B)With 7%(V/V)ethanol.(C)With 12%(V/V)ethanol.

由圖4可以看出，用 7%(V/V)或 12%(V/V)的乙醇脅迫轉基因酵母后，酵母的生長狀況與不用乙醇脅迫的對照組相比，酵母的生長受到抑制，添加7%(V/V)乙醇的實驗組在180 min后開始生長，但直到1 320 min，生長速度明顯慢于對照組。添加12%(V/V)乙醇的實驗組酵母始終沒有越過停滯期，可見這 2個濃度的乙醇都對酵母起到了較強的脅迫抑制作用(圖3)。另外，活性酵母細胞不容易被亞甲基蘭染色，顯微鏡下觀察到的酵母細胞較為透明，而死亡的酵母細胞容易被亞甲基蘭染成紫色，亞甲基蘭染色結果再次證明了 7%(V/V)和 12%(V/V)的乙醇都對酵母細胞起到了較強的脅迫作用，其中采用12%(V/V)的乙醇脅迫過度，導致大量酵母細胞死亡(結果未顯示)。7%(V/V)的乙醇誘導了TPS1啟動子大量啟動EGFP的表達。

圖4 酵母細胞轉化子在不同濃度乙醇脅迫下的生長情況Fig.4 Cell growth of the yeast transformants in presence of different concentration of ethanol.

本實驗室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生物化學機制研究發現，絮凝酵母的乙醇耐性與細胞內的海藻糖含量相關[11-12]，海藻糖也是酵母細胞在環境脅迫條件下積累的胞內產物，而海藻糖合成酶 TPS1是酵母海藻糖合成的關鍵酶，因此TPS1基因啟動子的活性強弱可以反映TPS1基因的表達情況，進而反映海藻糖合成酶的表達量和海藻糖在酵母細胞內的合成情況。以上研究結果揭示了PTPS1spsc在乙醇脅迫下表達明顯提高，證明了乙醇可在轉錄水平促進海藻糖的合成。

本實驗室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生化機理研究表明，乙醇耐性不同的絮凝顆粒群體的海藻糖合成情況具有明顯差別[11-12]，但是對海藻糖的合成與乙醇耐性的直接關系還不清楚。本文的結果表明，在一定濃度乙醇存在下，絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1的啟動子活性被迅速誘導，進而啟動海藻糖的合成，因此絮凝酵母海藻糖的生物合成與乙醇耐受性具有密切的關系。本文發現TPS1的啟動子活性在亞致死乙醇濃度下最高，顯示了細胞通過啟動海藻糖的合成有效保護其免受乙醇的毒害。文獻報道利用熱擊蛋白Hsp12啟動子驅動GFP的表達，發現該啟動子可以響應乙醇、高溫、高滲透壓等多種脅迫[9]，而本實驗室的研究結果顯示，絮凝酵母的TPS1基因啟動子活性只對乙醇有響應，對高溫和高糖條件沒有明顯響應，而且文獻報道Hsp12啟動子作用時間較短，80 min時GFP的表達量開始下降，這與本文所研究的啟動子PTPS1spsc啟動EGFP表達的持續時間較長，短時間內 EGFP的表達量無下降趨勢具有明顯不同，說明不同的乙醇脅迫相關基因的作用具有明顯差異，能在不同時間啟動相關代謝反應機制和細胞的相關防御反應。進一步的研究將揭示絮凝酵母海藻糖合成酶基因在超高濃度乙醇發酵過程中的表達量變化，并利用所建立的報告載體系統進一步研究絮凝酵母基因組內其他基因對其乙醇耐性的影響，深入揭示絮凝酵母乙醇耐性的分子機制，為選育耐受高濃度乙醇的菌株提供理論基礎。

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Cloning of the promoter region of the Trehalose-6-phosphate synthase gene TPS1 of the self-flocculating yeast and exploration of the promoter activity on ethanol stress

Bei Lin1,2, Xinqing Zhao1, Qiumei Zhang1, Liming Ma1, and Fengwu Bai1
1 Department of Life Science and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China 2 Department of Polytechnic, North College of Beijing University of Chemical Technology, Langfang 065201, China

Received:May 26, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:Natural Science Foundation of China(No.30500011), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358).

Corresponding author:Xinqing Zhao.Tel: +86-411-84707617; E-mail: xqzhao@dlut.edu.cn國家自然科學基金(No.30500011)，國家高技術研究發展計劃(863計劃)(No.2007AA10Z358)資助。