兼性厭氧復合菌群H纖維素降解和產乙醇能力及生態組成初探

杜然，李十中，章曉慶，王莉

清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084

兼性厭氧復合菌群H纖維素降解和產乙醇能力及生態組成初探

杜然，李十中，章曉慶，王莉

清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084

通過限制性培養條件和連續繼代培養，篩選獲得了一組具有高效穩定降解纖維素能力的復合菌群 H。該菌群在傳代30代以上仍能保持各項性狀穩定，其工作pH為6～9，3 d可以完全降解置于100 mL PCS緩沖液培養基中的濾紙，發酵液中能夠檢出1.54 g/L乙醇。通過16S rDNA擴增和DGGE的方法，對菌群在不同階段的微生物組成進行了研究，確定了琥珀酸嗜熱梭菌Clostridium thermo succinogene、產氣莢膜梭菌Clostridium straminisolvens和紫色板藍根梭菌Clostridium isatidis等多種可直接實現纖維素到乙醇轉化的菌株。菌群通過菌種之間的協同作用，共同維持了體系的穩定及降解能力的穩定。明確菌系的組成，對于進一步研究菌群降解機理、優化菌群和提高乙醇產率意義重大。

纖維素降解，微生物菌群，乙醇生產

Abstract:The recalcitrance of lignocellulosic biomass makes its hydrolysis by cellulases less effective, and the consolidated bioprocessing(CBP)strategy that combines enzyme production, cellulose hydrolysis and fermentation, particularly the synergetic role of different microbes in attacking cellulose component could be a solution.In this article, a facultative anaerobe microbial consortium named H was isolated, which exhibited high stability even after 30 subcultures, with pH ranging from 6 to 9.Within three days, 0.5 g filter paper immerged in 100 mL PCS buffer was completely degraded, and 1.54 g/L ethanol was produced,correspondingly.Further analysis on the component of the microbe consortium was carried out though 16S rDNA and DGGE, andClostridium thermosuccinogene,Clostridium straminisolvensandClostridium isatidisthat can directly convert cellulose to ethanol were identified, indicating thatClostridiumspp.played important role in cellulose degradation through the synergistic coordination of different species, and the characterization of the consortium will benefit the analysis of the underlying mechanisms as well as the optimization of the CBP process for more efficient cellulose degradation and ethanol production.

Keywords:cellulose degradation, microbe consortium, ethanol production

中國是農業大國，秸稈壘木質纖維素類物質的保有量驚人。據統計，每年僅農作物秸稈生產量高達7億多噸，農作物加工廢棄物，如稻殼、玉米芯和甘蔗渣等估計總量在1億噸以上[1-2]。若能通過生物手段將其轉換為可發酵糖類，再進一步發酵生產以纖維素乙醇為代表的第二代生物燃料，對于解決能源危機和環境問題有重大意義。纖維素乙醇目前主流的研究趨勢主要分為篩選更高效的纖維素酶，采用菌群的方式進行纖維素和乙醇的同步發酵，以及CBP技術。

目前生產纖維素酶的主要方法是利用單一菌株發酵以提取其中的纖維素酶[3-5]。但是由于單菌發酵生產的纖維素酶系配比不夠理想，于是有科學家提出復合菌的思路，如Thierie等[6]提出的采用數株梭菌組合形成的復合菌系，崔宗均等[7]提出的MC1復合菌系等。這些復合菌系是將已知的多種纖維素降解單菌進行簡單的組合，沒有考慮到不同菌之間的協同互補與抑制關系，因而其降解纖維素效率并不高。采用人工合成的同時具有纖維素糖化和乙醇轉化能力的菌群也同樣存在上述問題。本課題組以前人原生態分離高效菌群的研究為基礎，結合中藥理論“君臣佐使”原理進行了具有纖維素降解并生產乙醇能力的天然混合菌群篩選，并采用定向限制性培養的方式進行菌群結構的簡化[8]。采用該種方法獲得的混合菌群，不同菌在群落中各司其職，相互協作，具有較寬的工作溫度和 pH區間，極高的穩定性和抗逆性，同時保持了較強的纖維素降解能力[9]和一定的乙醇轉化能力。本文報道了一組兼性厭氧的高效穩定的纖維素分解菌群 H降解纖維素及產乙醇的性能，并對菌種的組成進行了初步的研究，為進一步研究其協同作用機理和優化菌群奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品分別取自天津河東區郊區、河南省鄭州市郊區、山東濟寧市任城區、內蒙古巴彥淖爾市五原縣。

篩選培養基成分[10]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，濾紙 5 g，微量元素液(ZnSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，CuSO4·5H2O，CoSO4·7H2O，Na2B4O7·10H2O，NaMoO4·2H2O，FeSO4)0.5 mL，蒸餾水 1 000 mL，pH 8.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌群篩選方法

取5 g土壤樣品接種于100 mL的液體培養基中，當其中濾紙完全崩解后，再按10%的接種量進行傳代，如此進行繼代培養50代以后進行研究。

1.2.2 纖維素分解活性的測定[11]

CMC 糖化力法：取 1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液 3.8 mL作為底物(用 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制)，加入經適當稀釋的酶液0.2 mL，在50℃反應30 min，加入1 mL DNS，1 mL 2 mol/L NaOH，沸水浴10 min，于540 nm測定還原糖量。以1 mL粗酶液反應1 min釋放1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

葡聚糖外切酶活力單位的測定：0.2 mL酶液與1.8 mL 1 mg/mL pNPC(對硝基苯纖維二糖苷)溶液(用 pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液配制)在 50℃反應30 min。加入2 mL 10%的NaCO3終止反應。然后在420 nm處測定消光值。

1.2.3 失重率的測定[11]

將0.5 g的濾紙(或其他纖維素物質)作為唯一碳源制作100 mL PCS，接種5 mL H菌液，50℃靜止培養，5 000 r/min 離心，用鹽酸和硝酸的混合液多次清洗沉淀以消除菌體[6]，然后 105℃烘干后稱重，計算失重量和失重率。

1.2.4 菌群生長過程中pH變化監測

采用德國MERCK 1.09543.0001精密pH試紙進行測定。

1.2.5 菌群DNA提取、16S rDNA PCR擴增及序列分析

菌群DNA提取采用Bio-red土壤基因組提取試劑盒提取菌群總DNA。

16S rDNA PCR擴增采用文獻[12]所述方法。

DGGE分析使用 DcodeTM Universal Mutation Detector System(BIO-RAD Laboratories，Hercu les，CA，USA)。操作步驟在Muyzer 等[13]的基礎上改良，見文獻[14]。引物 357F-GC-clamp：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCC TACGGGAGGCAGCAG-3′和 518R：5′-ATTACCGCG GCTGCTGG-3′進行16S rDNA的V3可變區擴增。優化后的PCR程序為95℃預變性4 min；95℃變性50 s，52℃退火45 s，72℃延伸45 s，25個循環；之后72℃延伸10 min。切膠回收純化后，電泳檢測，之后通過DGGE電泳進行條帶分離，分離后切膠回收，再采用引物：357F：5′-CCTACGGGAGGCAGC AG-3′和 518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′擴增出的16S rDNA PCR產物連接T載體轉入大腸桿菌，進行克隆驗證后，挑選單菌落送上海生工北京測序部測序，將測序結果在NCBI中比對。

1.2.6 濾紙降解液組成分析

采用島津GC/MS-QP2010氣質聯用色譜儀，數據庫為Nist database。氣相色譜柱采用Varian色譜柱CP-Wax 57 CB。檢測樣品為菌群發酵第3天的發酵液，采用高速離心的方法除去細胞、蛋白等碎片，取上清液進行TIC全譜檢測。氣相升溫程序為50℃初溫，以10℃每分鐘的速度升溫至160℃，保持7 min。質譜離子源溫度200℃，接口溫度200℃，載氣為氦氣。

2 結果與分析

2.1 H菌群發酵動力學研究

圖1表明了菌群降解濾紙過程中內切酶、外切酶、pH和失重率的變化趨勢。pH首先出現一個短暫的下降階段，在16 h時達到最低7，之后逐漸上升到7.5，至24 h時再次下降，直至60 h時到達最低點6.8，之后呈現持續增高趨勢；失重率呈現快速升高趨勢，至60 h左右保持穩定，失重率達到90%以上。經歷了最初接種帶來的波動后，內外切酶酶活變化大致呈正態分布曲線，在60 h達到最高值，并維持較高酶活至90 h，在此階段2種酶均保持了較高的酶活，此后酶活均開始呈下降趨勢。通過對pH和酶活變化的分析，可以一定程度上反映不同菌之間的相互協調關系[15]。

研究表明，在0～18 h之間pH呈下降趨勢至最低點 6.8，酶活開始上升，失重率也隨之升高，在12 h后，隨著葡聚糖內切酶、外切酶酶活的快速升高，失重率呈現加速升高的趨勢。但pH在24 h到達最高點 7.5后出現了快速下降的趨勢，并在酶活最高點附近達到最低點，原因可能是纖維素降解菌株在菌群中占據了主導地位，伴隨菌體的大量生長和產酶高峰的到來，纖維素快速轉化為發酵糖類并在發酵過程中產生了乙酸等代謝產物，從而導致pH值出現明顯的下降。在2種酶酶活達到最高點時，濾紙逐步耗盡，失重率不再變化[16-17]。之后pH穩定上升，酶活開始下降。分析其原因應當是隨著纖維素的耗盡，培養基中碳源匱乏導致菌體生長變緩進入衰退期，進而產酶下降，隨著菌體的大量死亡裂解，造成pH值出現升高的趨勢，即菌群中菌生長狀態的變化和代謝產物的變化共同作用導致了菌群特有的pH變化趨勢。另一方面，未經過任何改造或者培養條件優化的情況下，該菌群的內切酶活性最高可達1.93 IU，外切酶可以達到3.6 IU，充分說明了該菌群在降解纖維素中的高效性及其進一步研究的價值。

圖1 菌群H在生長過程中內切酶、外切酶酶活、pH和失重率的動力學曲線Fig.1 The kinetic curves of the endoglucanase, exonglucanase, pH, cell concentration and the degradation ratio of cellulose in the growing period of the microbial consortium H.

2.2 濾紙降解液組分分析

通過氣質聯用檢測，獲得了如圖2所示的色譜圖。

圖2 第3天發酵液氣質檢測色譜圖Fig.2 GCMS chromatogram of the fermentation broth at the 3rd day.

經過質譜圖的比對，保留時間1.747 min處的峰為乙醇峰，乙醇含量約為 1.54 g/L，保留時間6.565 min、8.058 min、8.798 min和9.323 min處峰分別為乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸。該檢測結果證明了菌群在具有高效纖維素降解能力的同時，部分菌株可以利用纖維素降解產生的可發酵糖或者纖維素降解的部分中間產物生產乙醇，即具有一步法生產纖維素乙醇的能力。同時，乙酸等其他有機酸的積累解釋了在酶活不斷升高過程中 pH持續下降的現象。若能通過優化菌群的結構提高可以利用纖維素生產乙醇的菌株比例，降低纖維素向乙酸等有機酸的轉化量，并通過馴化、人工合成等方式提高菌群的纖維素降解能力，則有望可以利用菌群進行纖維素乙醇的一步法生產。

2.3 菌群組成研究

通過DGGE電泳分離，獲得了如圖3所示的電泳條帶。

圖3 H全基因組16S rDNA的V3可變區DGGE電泳圖(左條帶所示為菌群培養36 h時16S rDNA的V3可變區電泳圖譜；右條帶為菌群培養72 h時16S rDNA的V3可變區電泳圖譜。限于切膠儀器分辨率，分別選取了其中的8條和10條條帶切膠進行測序分析)Fig.3 Electrophoretogram of the 16S rDNA V3 variable region of the genome of the microbial consortium H.The left and right bands were results of the samples collecting at the fermentation time 36 h and 72 h, respectively, and the bands numerated were selected for further analysis.

表1 菌群培養36 h和72 h時16S rDNA的V3可變區DGGE條帶序列比對后相似性結果Table 1 Alignment sequencing results of the DGGE bands of 16S rDNA V3 regions obtained at 36 h and 72 h

通過選擇，我們分別在A和B上切取較清晰并已經充分分離的8條和10條條帶，進行處理獲得序列信息后在 NCBI中比對，將獲得的結果中相似性最高的菌種信息列表如表 1所示，通過比對可以發現，在菌群可檢出的菌株中，以梭菌為優勢菌群，由于梭菌多為厭氧和兼性厭氧類型，整個菌群也具有了兼性厭氧的特性。梭菌在纖維素降解方面的研究開展的十分廣泛，已有眾多文獻報道了梭菌在降解纖維素方面的優勢，這就解釋了菌群具有較強的纖維素降解能力[18-24]。從組成上可以看出，除了具有纖維素降解能力的梭菌存在外，菌群中又輔以其他的或具有纖維素降解活性或不具有該活性的菌株，推測是由于這些菌株的存在，使菌群中的諸多菌相輔相成，共同作用成為了一個相對穩定的體系，進而使整個菌群具有了較強的抗逆性和環境適應性。同時，據相關文獻報道，諸如Clostridium thermosuccinogene、Clostridium straminisolvens、Clostridium isatidis[19,21-22]在降解纖維素的同時都會伴有代謝產物乙醇的生成，再結合對發酵液組分分析獲得的乙醇相關數據，進一步驗證了菌群利用纖維素一步法生產乙醇的可能性。另外部分菌株在生長過程中產生的表面活性劑類代謝產物也會一定程度上促進纖維素的降解[25-26]。

另一方面，通過對比表中不同時間的組成情況可以看出，即使對于一個穩定的菌群，其在不同階段的菌種組成也是不盡相同的，在不同的階段，隨著培養基中成分的變化，菌群中的組成也隨之變化，依據之前的酶活曲線，當達到降解最高峰，即酶活達到最高時，菌群中的優勢菌群為梭菌，由此可以推測，在菌群中起到主要的纖維素降解作用的菌應當是梭菌。由于梭菌主要進行的是厭氧發酵，因而其糖代謝主要產物為乙醇或者乙酸，隨著發酵的進行，乙醇和乙酸等會在體系中大量積累，正如氣質檢測所示，在發酵液中檢出的主要組分為乙醇和乙酸。

3 結論

本課題組利用傳統中藥“君臣佐使”原理，采用限制性繼代培養方法，構建并優化得到傳代穩定、纖維素降解能力強的兼性厭氧菌群 H，濾紙經其降解72 h后失重率高達90%，內切酶活性達1.93 IU，外切酶活性達3.6 IU。在發酵過程中，不同階段占據優勢的菌種是變化的，當具有高效纖維素降解能力的梭菌成為優勢菌后，達到了最高的纖維素酶酶活。同時，兼性厭氧菌群H具有一定的乙醇生產能力，經測定，在發酵第3天，發酵液中乙醇的積累量達到 1.54 g/L的濃度，顯示了其在一步法 CBP(Consolidate bioprocessing)發酵產乙醇方面的應用前景。

在之后的研究中還需要利用蛋白組學分析獲得的關于纖維素降解相關酶類信息更一步的解釋菌群降解纖維素的優勢，與基因組學獲得的菌群組成信息進行交互驗證，從而可以更有效地探索菌群優化和簡化的途徑，實現利用菌群進行一步法生產纖維素乙醇。

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Cellulose hydrolysis and ethanol production by a facultative anaerobe bacteria consortium H and its identification

Ran Du, Shizhong Li, Xiaoqing Zhang, and Li Wang
Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received:May 24, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No.2006BAD07A01).

Corresponding author:Shizhong Li.Tel: +86-10-62772123; Fax: +86-10-80194050; E-mail: szli@tsinghua.edu.cn“十一五”國家科技支撐計劃(No.2006BAD07A01)資助。