HPLC測(cè)定克艾特膠囊中綠原酸的含量

饒偉源，李茂

（廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022）

HPLC測(cè)定克艾特膠囊中綠原酸的含量

饒偉源*，李茂

（廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022）

目的：建立克艾特膠囊的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC，色譜柱：kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈－0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：室溫。結(jié)果：當(dāng)進(jìn)樣量在0.026 8～1.068 0μg時(shí)，線性關(guān)系良好，r＝0.999 7，平均回收率為99.18%，RSD＝0.97%，結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于本品的質(zhì)量控制。

克艾特膠囊；薄層色譜法；高效液相法；綠原酸

克艾特膠囊是廣東湛江賢博科技有限公司委托我院研究開發(fā)的治療艾滋病的新藥，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。克艾特膠囊主要由金銀花、海藻、半邊蓮等14味中藥經(jīng)提取加工制成，具有益氣養(yǎng)陰，解毒散瘀，生津安神的功能。用于艾滋病毒感染及艾滋病感染的并發(fā)癥等。為了更好控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)金銀花中的綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定［1］，結(jié)果表明本法操作簡(jiǎn)便，可作為本品的質(zhì)量控制。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀器

日本島津公司LC-10AT高效液相色譜議；SPD-10A紫外檢測(cè)器；威瑪通用多媒體色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)10753－200212，供含量測(cè)定用）。乙腈為色譜純，水為高純水，磷酸為分析純。克艾特膠囊（本院制劑室提供，批號(hào)090601，090602，090603）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相；乙腈－0.4%磷酸溶液（10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)以綠原酸計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶液制成每1 mL含5.5μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10 g，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，浸漬30 min，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性干擾試驗(yàn)

取缺金銀花藥材的陰性樣品，按上述“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照在綠原酸出峰位置無吸收峰，表明處方中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取綠原酸對(duì)照品13.35 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。精密量取上述對(duì)照品貯備液0.25，0.5，1，3，5，10 mL，分別置25mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。以綠原酸對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2 746 699X＋20 126，r＝0.999 7。結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)樣量在0.026 8～1.068 0μg時(shí)，綠原酸進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

對(duì)同一批（090601批）供試品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD＝0.54%（n＝6）。結(jié)果表明本法的精密度良好。

圖1 對(duì)照品及克艾特膠囊的HPLC圖

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一批樣品（090601批）平行測(cè)定6份，綠原酸含量的平均值0.141 mg·g－1，RSD＝0.86%（n＝6），結(jié)果表明本法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)同一份（090601批）供試品溶液，每隔4 h測(cè)定1次，共測(cè)定7次，結(jié)果7次測(cè)定綠原酸含量的平均值為0.140 mg·g－1，RSD＝0.80%（n＝7），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率測(cè)定

精密量取線性關(guān)系考察項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液8 mL，置500 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（濃度為2.136μg·mL－1）。精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下克艾特膠囊（綠原酸含量為0.141 mg·g－1）約0.75 g，平行取6份樣，分別精密加入上述綠原酸對(duì)照品溶液50 mL，按上述擬訂的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品測(cè)定

按擬訂的含量測(cè)定方法，測(cè)定了本品090601，090602，090603 3批樣品中綠原酸含量，結(jié)果分別為68，56，63μg／粒。

3 討論

綠原酸在溶液中不穩(wěn)定，受熱及見光易分解，故不宜采用加熱回流進(jìn)行提取，加入溶劑后，浸漬30 min，然后超聲處理15 min提取效果顯著更好。故供試品溶液的制備，采用先浸漬30 min，然后超聲處理。本實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2005年版一部“金銀花”項(xiàng)下【含量測(cè)定】項(xiàng)所使用的流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)調(diào)整最后采用乙腈－0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相進(jìn)行分析，結(jié)果綠原酸與相鄰峰可達(dá)到基線分離，所以確定采用乙腈－0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相。本法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可作為本品中綠原酸的質(zhì)量控制方法。

表1 綠原酸加樣回收率

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：152-153.

Determination of Chlorogenic Acid in Ke′ai Te Capsules by HPLC

Rao Weiyuan，Li Mao
（Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences，Nanning Guangxi530022，China）

Objective：To establish a method for determination chlorogenic acid in Ke′ai Te Capsules.Methods：The method of HPLC was used，chromatographic column：kromasil C18column（4.6 mm×250 mm，5μm），the mobile phase consisted of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution（10∶90），the flow rate was1.0mL·min－1，the detection wavelength was 327 nm；the column temperature was room temperature.Results：The linear range of chlorogenic acid was 0.026 8～1.068 0μg，r＝0.999 7，and the average recovery was 99.18%，RSD＝0.97%.Conclusion：The method is accurate，repeatable and simple，it can be used for quality control of Ke′ai Te Capsules.

Ke′ai Te Capsules；TLC；HPLC；Chlorogenic acid

*饒偉源，Tel：（0771）5868874，E-mail：nn＿rwy163.com.cn＠163.com

2010-03-19）