比色法測定板栗花中總黃酮的含量△

馬宏峰，高麗梅，趙光云，吳立軍，高慧媛*

（1.遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北 遷西 064300；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

比色法測定板栗花中總黃酮的含量△

馬宏峰1，高麗梅2，趙光云2，吳立軍2，高慧媛2*

（1.遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北 遷西 064300；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的：探索板栗花中總黃酮醇提取工藝的最佳條件，并建立板栗花中總黃酮的含量測定方法。方法：以1%AlCl3甲醇溶液為顯色劑，山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷為對照品，采用比色法測定。結(jié)果：山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷檢測濃度在0.008～0.048 mg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A＝19.089C＋0.026 3（r＝0.999 8），平均回收率為96.54%，RSD＝0.63%（n＝6），用乙醇提取法提取的板栗花中總黃酮含量達(dá)6.92 mg·g-1。結(jié)論：本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于板栗花中總黃酮的含量測定。

板栗花；山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷；總黃酮；比色法；含量測定

板栗為殼斗科（Fagacaea）栗屬（Castanea）植物的落葉果木。板栗花為板栗的雄性花序，其味微苦，澀，性微溫，具清熱、燥濕、止血、散結(jié)的功效。主治泄瀉，痢疾，帶下，便血等［1］。板栗花中主要含有揮發(fā)油、酚酸類、三萜類、甾醇類、生物堿類、黃酮類化合物，而黃酮類化合物具有降脂、降糖、抗血栓、抗氧化等多種生理活性。實驗采用L9（34）正交試驗設(shè)計法，考察了以醇為提取溶劑，醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)對板栗花中總黃酮提取工藝的影響，確定最佳提取工藝。采用三氯化鋁比色法，以山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷為對照品，建立了板栗花中總黃酮的含量測定方法，為其資源的合理開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU UV-1700型紫外可見分光光度計［島津國際貿(mào)易（上海）有限公司］，ESJ 210-4型電子天平（沈陽華騰電子稱量儀器有限公司），DZF-150型真空恒溫干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品（自制，HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上）。其余試劑均為分析純。

1.3 材料

板栗花為2008年6月初采自河北省遷西縣，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)孫啟時教授鑒定為板栗Castanea mollissimaBlume花序。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量分析方法的建立

2.1.1 板栗花中總黃酮的醇提取工藝考察 采用正交試驗法，選取乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)4個因素，因素水平見表1。

表1 醇提取工藝因素水平表

稱取板栗花粗粉10 g，15倍量石油醚蒸餾脫脂1 h后，按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗，提取液合并，過濾，減壓回收，干燥，得浸膏，按浸膏質(zhì)量／藥材質(zhì)量計算浸膏得率。浸膏與聚酰胺（1∶1）拌樣，揮干，待上樣。量取80 mL聚酰胺，用蒸餾水浸泡1 d，攪拌排除氣泡，裝入層析柱中，用蒸餾水洗至從柱子里流出來的水清澈為止。上樣，分別用水，90%乙醇洗脫10個保留體積，將90%乙醇洗脫液減壓回收，干燥后用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，搖勻。精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1%三氯化鋁（AlCl3）溶液，用甲醇定容至刻度線，放置20 min，以甲醇為隨行空白試劑，在399 nm處測定吸光度（A），根據(jù)山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷的回歸方程計算浸膏中總黃酮的含量。以浸膏得率和浸膏中總黃酮含量進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時以各指標(biāo)最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重。本實驗中，將浸膏中總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.7，浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3，以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計分析［1-2］。結(jié)果見表2、表3。其中綜合評分值Y＝0.3X1×100／32＋0.7X2×100／3.58。

表2 正交設(shè)計試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

表2和表3結(jié)果表明，在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素對提取效果的影響程度依次為A＞D＞C＞B，即：乙醇濃度＞提取次數(shù)＞提取時間＞乙醇用量，各因素的最佳水平為A3B3C3D2。考慮到提取1.5 h與2 h結(jié)果差別不大，所以最后選定提取時間為1.5 h，最佳提取工藝為A3B3C2D2，即：20倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h。

2.1.2 對照品溶液的配置 精密稱取真空干燥至恒重的山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷8.0 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得濃度為0.16 mg·mL-1的山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取板栗花粗粉10 g，15倍量石油醚脫脂1 h后，用20倍量、70%的乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，提取液合并，過濾，減壓回收，干燥，得浸膏2.1 g，與聚酰胺（1∶1）拌樣，揮干，待上樣。量取80 mL聚酰胺，用蒸餾水浸泡1 d，攪拌排除氣泡，裝入層析柱中，用蒸餾水洗至從柱子里流出來的水清澈為止。上樣，分別用水、90%乙醇洗脫10個保留體積，將90%乙醇洗脫液減壓回收，干燥，用甲醇溶解定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.4 1%AlCl3甲醇溶液的制備 稱取1.00 g AlCl3于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻線，搖勻，靜置。

2.1.5 顯色劑的選擇 精密吸取供試品溶液2份，各0.1 mL，于10 mL容量瓶中。其中一份加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH溶液4 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。另一份加入1%AlCl3溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。結(jié)果表明，5%NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH顯色后產(chǎn)生大量沉淀影響含量測定結(jié)果，且在紫外可見分光光度200～800 nm進(jìn)行波長掃描時樣品在510nm左右無吸收，見圖1。而三氯化鋁顯色后在405 nm有最大吸收，見圖2，故確定1%AlCl3為顯色劑。

2.1.6 檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液1.5 mL，于25 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于紫外可見分光光度200～800 nm進(jìn)行波長掃描，見圖3。結(jié)果表明，山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷在399 nm波長處有最大吸收，故確定其為檢測波長。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品儲備液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度（A）。以A值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得線性方程A＝19.089C＋0.026 3，r＝0.999 8，結(jié)果表明山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.008～0.048 mg·mL－1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度，重復(fù)測定5次，計算RSD＝0.91%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗 取板栗花粗粉5份，各10 g，按2.1.3項下制備樣品溶液，精密吸取0.1 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度，計算RSD＝0.68%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。分別在0，10，20，30，40，50，60 min時，以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度，計算RSD＝0.87%。

2.2.5 加樣回收率試驗 取6份供試品溶液，各0.05mL，于10mL容量瓶中，分別加入0.16 mg·mL－1對照品溶液0.5，0.5，0.7，0.7，0.9，0.9mL，及1mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度，結(jié)果見表4。

2.3 含量測定

取板栗花粗粉3份，各10 g，按2.1.3項下制備樣品溶液，精密吸取0.1 mL，于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以甲醇為隨行空白試劑，于399 nm處測定吸光度，按回歸方程計算藥材中總黃酮的含量。結(jié)果見表5。

表4 山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷加樣回收率

表5 板栗花中中山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷含量測定

3 討論

本實驗以浸膏得率和浸膏中總黃酮含量為指標(biāo)，在正交工藝考察時，采用綜合評分的方法優(yōu)選板栗花中總黃酮的最佳提取工藝條件。在本實驗中，將浸膏得率設(shè)為正交因素去考察，因為有效成分的含量是一個重要因素，但浸膏得率也是生產(chǎn)中一個考察的因素，兩者應(yīng)兼顧才行。最后根據(jù)各指標(biāo)在考察中所占的比例進(jìn)行考察更為合理。

硝酸鋁比色法要求物質(zhì)中含有鄰二酚羥基，且鄰二酚羥基對位沒有取代［3］。文獻(xiàn)［4］采用此法對板栗花中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了考察，然而，本實驗在以蘆丁為對照品的硝酸鋁比色法進(jìn)行總黃酮含量測定時發(fā)現(xiàn)，只有蘆丁在500 nm有吸收峰，而樣品溶液無吸收，說明板栗花中的主要黃酮類不具有該顯色法所要求的化學(xué)基團(tuán)。因此，以蘆丁為對照品的硝酸鋁顯色法不適合板栗花中總黃酮含量的測定。而具有3-OH或5-OH的黃酮類化合物均可與三氯化鋁發(fā)生顏色反應(yīng)，顯色范圍更廣，故本實驗選擇三氯化鋁為顯色劑。

板栗花中含大量的黃酮類化合物。黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛作用及免疫調(diào)節(jié)等作用。課題組前期研究結(jié)果表明山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷對Hela細(xì)胞有很強的抑制作用，而且板栗花中的黃酮類化合物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于板栗其他部位中的含量，因此對于板栗花的研究與開發(fā)具有重要的意義。本文采用AlCl3比色法，以山柰酚-3-O-［6″-O-反式-對-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷為對照品，對板栗花中總黃酮含量進(jìn)行了測定，實驗方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為板栗花及相關(guān)產(chǎn)品中總黃酮含量測定的一種方法。

［1］Zhang T，Xu L Y，Tao JS，etal.Applying gradingmethods of synthesizing multiple guidelines to optimizing extract technology forRadix Purariae［J］.Chin Tradit Herb Drugs（中草藥），2004，35（1）：38-40.

［2］周素琴，趙慧，焦海勝，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選抗病毒顆粒水提工藝的研究［J］.中成藥，2008，30（3）：439-441.

［3］吳雪輝，江南，梁穎詩，等.微波提取板栗花中黃酮類物質(zhì)的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（8）：106-109.

［4］劉東平，周亞村，王先榮.羅布麻葉總黃酮的測定方法探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，5（3）：614-616.

《中藥資源可持續(xù)利用導(dǎo)論》

《中藥資源可持續(xù)利用導(dǎo)論》由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳士林、肖培根教授主編，分為10章，共80萬字。本書系統(tǒng)介紹了我國中藥資源可持續(xù)利用的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。內(nèi)容包括中藥資源調(diào)查、中藥區(qū)劃與產(chǎn)地適宜性分析、中藥資源野生撫育與引種馴化、栽培藥材生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展、中藥新資源開發(fā)利用，以及中藥資源可持續(xù)利用模式和戰(zhàn)略、瀕危中藥資源評價與監(jiān)測等，同時附有研究實例。本書內(nèi)容豐富，具有較高的學(xué)術(shù)和實用價值，可供從事中藥資源研究及相關(guān)產(chǎn)業(yè)人員使用參考。

地 址：北京市海淀區(qū)西四環(huán)北路15號依斯特大廈8層郵 編：100195

聯(lián)系電話：010－88468211

Content Determination of Total Flavonoids from Flowers of Chinese Chestnut by Colorimetry

Ma Hongfeng1，Gao Limei2，Zhao Guangyun2，Wu Lijun2，Gao Huiyuan2
（1.Qianxi County Chestnut Research＆Development Center，Qianxi Hebei064300，China；2.School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110016，China）

Objective：To explore the optimal method of extracting total flavones and establish the method for the content determination of total flavonoids in the flowers of Chinese chestnut.Methods：Colorimetry analysis was employed 1%AlCl3worked as colour developing reagent，and kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside was used as the reference substance.Results：A good linear relationshi Pwas achieved over the concentration range of0.008～0.048 mg·mL-1for kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside with an average recovery of 96.54%，RSD＝0.63%（n＝6）.The equation of linear regression wasA＝19.089C＋0.026 3（r＝0.999 8）.The total flavones in the flowers of chinese chestnut by ethanol extracting could achieve 6.92 mg·g－1.Conclusion：The method was accurate，rapid，accurate and reproducible，and can be used to determine the total flavones in the flowers of Chinese chestnut.

Flowers of chinese chestnut；Kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside；Total flavones；Colorimetry；Content determination

河北省科技廳項目——板栗功能產(chǎn)品加工及廢棄物綜合利用技術(shù)研究與示范（09231001D）

*高慧媛，E-mail：gaohuiyuan1997＠yahoo.com.cn

2010-05-18）