生物反硝化脫氮碳源上微生物的多樣性

王小嬌 席亞萍 張 明

華東師范大學資源與環(huán)境學院 （上海 200062）

生物反硝化脫氮碳源上微生物的多樣性

王小嬌 席亞萍 張 明

華東師范大學資源與環(huán)境學院 （上海 200062）

為了研究廢棄農(nóng)作物作為反硝化脫氮處理的新型碳源和生物膜載體中微生物的多樣性及微生物的群落結構，將玉米芯作為反硝化碳源和生物膜的載體布置在河道中，采集同步脫氮過程中的玉米芯樣品并提取微生物總DNA，使用細菌通用引物對（GC341F和518R）從總DNA中成功擴增出目標16SrDNA片段，然后對擴增的16SrDNA進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）測定，對凝膠染色并進行條帶統(tǒng)計分析和切膠測序。結果表明以玉米芯為載體的生物膜優(yōu)勢菌變化規(guī)律與生存環(huán)境的變化存在較好的相關性，當水體中溶解氧提高后，生物膜上的優(yōu)勢種群以好氧/兼氧的異養(yǎng)桿狀細菌Bacillus為主。

16SrDNA PCR DGGE

0 引言

由于城市化進程的加快和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，氮、磷等營養(yǎng)元素通過多種途徑匯入河流等水體，造成水體污染和富營養(yǎng)化問題日益突出。我國南方河流普遍存在低碳高氮現(xiàn)象，水體磷氮比過低使河流自凈過程中反硝化所需的碳源不足，導致硝態(tài)氮難以有效去除。

本測試基于生物硝化-反硝化原理，研究了在模擬河道中提高水體中的碳濃度，營造反硝化環(huán)境，這種好氧、兼氧的生物膜環(huán)境為脫氮提供了良好的環(huán)境。盡管很多研究者對脫氮的工藝條件進行了大量研究，但是對其脫氮的微生物機理尚不清楚，現(xiàn)代分子生物學為深入研究環(huán)境中微生物提供了先進的技術手段。

通過從模擬河道裝置中提取總DNA，并進行聚合酶鏈式反應（PCR）和變性梯度凝膠（DGGE）和DNA測序等新的分子生物學技術，對生物膜中細菌多樣性和微生物群落進行了研究，以獲得生物膜中細菌組成和動態(tài)變化規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

待模擬河道裝置開始運行后，分別選取不同的時間點，采集載體玉米芯上的生物膜，具體采樣時間及裝置的運行狀態(tài)見表1。

表1 采樣點時間及運行狀態(tài)表

1.2 總DNA的提取

將從反應器中采集的玉米芯樣品切割成2 cm大小，放入經(jīng)滅菌處理的含100 mL磷酸鹽緩沖溶液和玻璃珠（直徑3～4 mm）的三角燒瓶中，漩渦振蕩60 min，將玉米芯表面生物膜充分剝離，取含生物膜的液體部分10 000 r/min離心8 min，棄去上清液，沉淀部分即為含玉米芯表面生物膜的樣品。

離心沉淀的生物膜樣品采用進口的FastDNA SPIN Kit for Soi（lQ-biogene,CA,USA)試劑盒進行總DNA的抽提和純化。過程如下：取300 μL生物膜樣品加入122 μL的MT緩沖液，用珠磨器（Mini Beadbeater，USA）震蕩破碎樣品40 s；將離心管中的樣品在12 000 r/min下離心30 s；將上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，加入250 μL PPS溶液，用手震蕩混勻10次；在12 000 r/min下將離心管中混勻的樣品離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到15 mL的干凈離心管中；在15 mL離心管中加入1 mL吸附懸浮液；顛倒混勻離心管2 min，靜置沉淀3 min；沉淀后移除500 μL上清液，將離心管中樣品重新混勻，吸出600 μL混和液到試劑盒提供的Spin濾管中，在12 000 r/min下離心1 min；將剩余的混和液加入Spin濾管中離心；在Spin濾管中加入500 μL SEWS-M溶液，在12 000 r/min下離心1 min；棄去離心液，繼續(xù)在12 000 r/min下離心2 min，以干燥剩余的SEWS-M溶液；將SpinTM濾管放入另一個干凈的離心管中，在室溫下放置干燥5 min；在SpinTM濾管中加入60 μL超純水，手指輕彈管壁，在12 000 r/min下離心1 min,離心液即為提取的DNA樣品。

采用紫外分光光度法對提取的總DNA進行定量測定。目前認為，在波長260 nm紫外線下，1OD（光密度數(shù)）的光密度相當于雙鏈DNA濃度為50 μg/mL。采用微量石英比色皿中將提取的DNA樣品稀釋后測定A260的數(shù)值，則DNA濃度C（ng/μL）＝A260×稀釋倍數(shù)/0.02。

1.3 PCR擴增

1.3.1 引物

根據(jù)文獻，選用真細菌16SrDNA V3區(qū)通用擴增引物GC341F(5'CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG CAG 3')和518R(5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3')，引物由上海生工公司合成。

1.3.2 擴增體系

PCR擴增體系為：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反應緩沖液為3 μL，其中Mg2+為1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）為3 μL，引物為0.5 μL（10 μmol PL），最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR試劑購自上海生工公司。

1.3.3 擴增程序

PCR反應在PCR儀（PTC-0200G、ALS-1244G、Bio-Rad，USA）上進行，反應過程為94℃變性5 min，然后94℃變性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸2.5 min，循環(huán)29次，然后在72℃保持10 min。

1.3.4 PCR擴增檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色并拍照（Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD，USA）。電泳檢測時采用Marker DL2000（2 000、1 000、750、500、250、100 bp）作為分子量大小的標記。

1.3.5 DGGE分析

采用Dcode Universal Mutation System DGGE電泳系統(tǒng)（Bio-rad，USA）進行DGGE分析，10%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度35%～55%（100%變性劑含7 mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺），上樣量為25 μL PCR產(chǎn)物，60℃、85 V恒定電壓下電泳8 h。電泳結束后，凝膠用SYBR Green核酸染液染色30 min，于GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）上成像檢測并拍照。

1.3.6 測序

對聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶在Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)上（BIO-RAD，USA）進行切膠，回收的凝膠條帶搗碎于30 μL無菌ddH2O中，放置過夜，讓凝膠上的DNA溶解，而后進行PCR擴增，采用由上海生工合成的細菌16SrDNA通用引341F（5'CCTACGGGAGGCAGCAG 3'）和518R（5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3）'進行PCR擴增。用于后續(xù)的DGGE.PCR擴增體系為：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反應緩沖液為3 μL，其中Mg2+為1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）為3 μL，引物為0.5 μL（10 μmol PL），最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR反應的程序同1.3.3。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序。

2 結果和分析

2.1 生物膜總DNA的提取

玉米芯生物膜樣品總DNA的提取是采用PCR-DGGE技術進行分析的前提和關鍵步驟。DNA提取純度影響后續(xù)的PCR擴增和多態(tài)性分析，提取的不完整性則會造成微生物種群多樣性的流失。從7個玉米芯生物膜樣品中提取的DNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗（見圖1）。

圖1 玉米芯生物膜總DNA的提取

電泳結果顯示，本研究采用的提取方法可以順利提取出樣品中的總DNA。

2.2 PCR產(chǎn)物

電泳檢測結果見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測圖

由圖2可知，用引物GC341F/518R對玉米芯生物膜總DNA樣品擴增后的DNA片段大小約為220 bp，與相應16SrDNA上目的片斷長度177 bp和GC夾（40 bp）長度之和相當，因此認為用引物341FGC/518R對玉米芯生物膜DNA的PCR實驗結果可靠，可用于下一步DGGE分析。

2.3 PCR-DGGE-切膠測序

玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE指紋圖譜見圖3。

圖3 玉米芯生物膜擴增的16SrDNA進行DGGE圖譜

將玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE圖譜中的主要優(yōu)勢條帶進行DGGE切膠回收，采用PCR-DGGE凝膠電泳多次純化后切膠，PCR擴增后送上海生工公司測序。

2.4 優(yōu)勢菌群16SrDNA片段測序（比對結果見表2）

表2 部分優(yōu)勢菌16SrDNA DGGE片斷測序分析結果

表2 （續(xù)）

從表2可知，優(yōu)勢菌群主要包括Bacillus為好氧/兼氧的異養(yǎng)細菌，Clostridiaceae等均為兼氧/厭氧的異養(yǎng)細菌，體內(nèi)均含有硝酸還原酶。這與這些玉米芯所處的生境均相吻合。

硝酸還原酶（nitrate reductase）可分為參與硝酸鹽同化的同化型還原酶和催化以硝酸鹽為活體氧化的最終電子受休的硝酸鹽呼吸異化型（呼吸型）還原酶。同化型存在于高等植物、藻類、菌類及細菌，是由含Mo、黃素和正鐵血紅素的亞單位所成的酶，即分子內(nèi)具有小的電子遞體。菠菜、小球藻的酶其分子量約20萬，作為電子供體，藍藻為鐵氧還蛋白，菌類主要為NADPH，而綠色植物主要為NADH，可由硝酸鹽誘導，可被氨和有機氮的抑制。異化型酶存在于許多兼性好氧性細菌中，多為與膜結構結合的不溶性的，一般含鐵及鉬分子量數(shù)十萬，似以細胞色素為電子供體，而專性嫌氣性細菌產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的酶是可溶性的，以鐵氧還蛋白為電子供體。

3 結論

本測試所用的方法能成功地提取玉米芯載體上微生物DNA。以玉米芯為載體和碳源的生物膜上優(yōu)勢種的變化規(guī)律與裝置的運行狀況呈現(xiàn)較好的相關性：即當水體溶解氧水平較低時，生物膜上的優(yōu)勢種以兼氧/厭氧的Clostridium等反硝化異養(yǎng)菌為主，當水體中溶解氧水平提高后，生物膜上的優(yōu)勢種以好氧/兼氧的Bacillus等異養(yǎng)桿狀細菌為主。好氧/兼氧的異養(yǎng)反硝化細菌的出現(xiàn)更好地為高溶解氧水平下模擬河道裝置的反硝化脫氮提供了理論支持。

（略）

Q935

王小嬌 女 1982年生 華東師范大學資源與環(huán)境學院環(huán)境科學系在讀碩士 研究方向：環(huán)境微生物

2010年3月