高溫油藏采出液中嗜熱產甲烷古菌的分離鑒定

劉海昌，蘭貴紅，劉全全，張文靜，曹毅，鄧宇，張輝

1 農業部能源微生物與利用重點開放實驗室，成都 610041

2 四川大學生命科學學院，成都 610065

研究報告

高溫油藏采出液中嗜熱產甲烷古菌的分離鑒定

劉海昌1，蘭貴紅2，劉全全1，張文靜1，曹毅2，鄧宇1，張輝1

1 農業部能源微生物與利用重點開放實驗室，成都 610041

2 四川大學生命科學學院，成都 610065

為了進一步從高溫油藏中發掘新的微生物種質資源，采用 Hungate 厭氧操作技術從大港油田油井采出水中分離出一株嗜熱自養產甲烷桿菌DL-7。生理生化結果顯示菌株DL-7只能夠利用H2/CO2生長，不利用甲酸、甲醇、三甲胺、乙酸和二級醇類；最適生長溫度60℃；最適鹽濃度0.8 g/L；最適pH為7.0～7.5；只有在添加酵母粉的培養基中才可以較好生長。16S rRNA序列比對結果顯示菌株DL-7與標準株M. marburgensisDSM 2133T (X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%。

油藏微生物，熱自養產甲烷桿菌，系統發育分析

Abstract:To explore new microbial resources in deep subsurface oil reservoirs, strain DL-7 was isolated with Hungate technology from oil reservoir water sampled from Dagang oilfield, China. Physiological and biochemical examinations showed that H2/CO2is the unique substrate of the strain, which cannot metabolize formate, methanol, trimethylamine, acetate and other secondary alcohols. The optimum growth conditions were further identified to be 60°C, pH 7.0?7.5 and 0.25% NaCl. Moreover, the strain cannot grow without yeast extract. Analysis of its 16S rRNA sequence indicated that a similarity of 99.7% presents between the strain and the model speciesM. marburgensisDSM2133T (X15364).

Keywords:microorganisms in petroleum reservoir, thermautotrophic methanogen, phylogenetic analysis

已有的地球化學證據表明，產甲烷古菌進化史可以追溯到35億年前，幾乎等同于地球生命的進化史。盡管產甲烷古菌是地球上最古老的物種之一，但它們卻廣泛分布于各種環境中[1]。地下油藏是一個特殊的生境，生物地球化學研究結果證實，產甲烷條件下的烴降解是地下油藏中烴類物質的主要代謝途徑[2]；分子生態研究也表明，在缺氧、高溫、高礦化度和營養匱乏的油藏中分布著種類豐富的產甲烷古菌。近年來，我們從高溫油藏中分離到多株嗜熱產甲烷古菌，其中包括產甲烷古菌新科1個 (甲熱球菌科 Methermicoccaceae[3]) 和新種 1個 (石油甲烷袋狀菌Methanoculleus receptaculi)[4]。目前分離到的產甲烷古菌分布于3個綱、6個目、15科、33屬共計155個種。從1972年[5]第一株熱自養產甲烷桿菌的分離到現在，研究人員已經從多種生境中分離到了數十株熱自養產甲烷桿菌，它們被劃分成6個種[6]。嗜熱產甲烷桿菌屬Methanothemobacter是高溫油藏中較為普遍的一類產甲烷古菌，同時這類產甲烷古菌也廣泛分布于高溫人工厭氧反應器的活性污泥中。菌株 DL-7分離于大港油田油藏采出水，它與嗜熱產甲烷桿菌屬中菌株M. marburgensisDSM2133T(X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%，它只能利用H2/CO2生長，代時較長，約為6 h，生長溫度為47℃～68℃。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品取自大港油田莊海8背斜區塊3號采油井，該油井為非注水井，井頂深為3 364.59 m，井底深為4 098.41 m，油層有效厚度為733 m。原油密度為0.9543 g/mL(20℃下測得)，粘度為 599.0 mPa·s (50℃下測得)。油藏溫度65℃～75℃。

1.2 富集、分離和純化

1.2.1培養基

采用亨蓋特厭氧操作改良技術[7]分離純化。富集培養[8]采用 MB培養基，分離培養基采用Medi2um141 (DSMZ)，純化培養基采用Medium 119(DSMZ)。

1.2.2操作方法

采用亨蓋特厭氧操作改良技術進行液體梯度稀釋和固體滾管分離純化。25 mL厭氧管或120 mL血清瓶中加入無氧培養基，頂空為氮氣，121℃高壓滅菌30 min，接種后充入H2+CO2(V/V=4∶1，最終壓力約200 kPa) 混合氣，60℃培養。

1.3 形態觀察

采用熒光相差顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌體形態，電鏡照片的制作參見文獻[9]。

1.4 生理生化鑒定

檢測：使用Nikon Eclipse 80i相差顯微鏡觀察，用Nikon DXM-1200C相機拍照：甲烷含量的測定采用島津GC-2010氣相色譜儀；電鏡照片采用AMRAY掃描電鏡觀察拍照[9]。

1.4.1生理實驗

生長條件測定包括最適pH值、最適生長溫度和最適NaCl濃度試驗。

1.4.2生化實驗

底物實驗、刺激因子實驗、抗生素敏感性實驗均采用改良的Medium141無機鹽培養基。

不同底物 (終濃度) 利用實驗：H2/CO2(V/V=20 mL/5 mL)、甲酸鹽 (50 mmol/L)、甲醇(50 mmol/L)、甲胺 (50 mmol/L)、三甲胺(50 mmol/L)、乙酸鹽 (50 mmol/L)、乙醇(50 mmol/L)分別作為唯一碳源。

不同刺激因子 (終濃度) 實驗：酵母粉0.2%、胰酶解酪蛋白0.2%、復合維生素溶液1%(V/V)、微量元素溶液 1%(V/V)、瘤胃浸提液 1%(V/V)、污泥浸提液 1%(V/V)、NaAC 50%、NiCl20.02%、Na2WO40.02%、Na2MoSO40.02%、HS-CoM 0.025%。

不同抗生素抑制實驗：紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、利福平、氯霉素，終濃度均為200 μg/mL。

1.5 16S rRNA序列擴增、測序及系統發育樹構建

1.5.116S rRNA基因擴增與測序

提取基因組 DNA作為模板，用產甲烷菌 16S rRNA特異性引物進行 PCR擴增。正向引物Met-86F：5′-GCTCAGTAACACGTGG-3′，反向引物Met-1340R：5′-CGGTGTGTGCAAGGAG-3′。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1.5 min，40 個循環；72 ℃ 10 min 。1%瓊脂糖電泳，回收產物與載體pMD-18連接，轉化至E. coliJM109，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.5.2系統發育樹的構建

將菌株的 16S rRNA測序結果提交 GenBank核酸序列數據庫進行BLAST，使用Clustalx(1.83)軟件將與之同源性較高的產甲烷菌的16S rRNA序列進行比對，通過MEGA(4.1) 軟件采用鄰位相鄰法繪出系統發育樹并進行 Bootstape穩定性檢驗(1 000 次)[10]。

1.6 (G+C) mol%含量的測定

根據熱變性溫度法[11](Tm值法) 測定基因組(G+C) mol%。測定菌株 DNA 的熱變性溫度 (Tm值)，同時測定E. coliK12的Tm值。根據公式[11](G+C) mol%=51.2+2.08×[Tm(X)?Tm(K12)]計算出(G+C) mol%。

2 結果與分析

2.1 形態特征

實驗表明，菌株DL-7革蘭氏染色呈陽性，菌體表面光滑無鞭毛，不運動，直徑 0.35～0.45 μm，長2.5 μm～5 μm，具有彎曲和直桿微彎2種形態，單生、成對、多數成聚集狀態存在。60℃培養10 d長出菌落，菌落淡黃色、圓形、邊緣整齊。于紫外光(420 nm) 下產生綠色熒光，圖1為液體培養條件下處于對數生長期的熒光照片，圖 2液體培養基中菌體掃描電鏡照片。

圖1 DL-7紫外熒光顯微照片 (100×)Fig.1 Fluorescence micrograph of strain DL-7 (100×).

圖2 DL-7掃描電鏡照片Fig.2 Electron micrograph of strain DL-7.

2.2 生理生化特征

2.2.1生理特征

菌株DL-7生長溫度范圍為47℃～68℃，最適溫度為 60℃(圖 3)。實驗發現，菌株 DL-7生長 pH 6.0～8.5，最適pH為7.0～7.5 (圖4)。最適NaCl濃度為0.8 g/L (圖5)。表1是菌株DL-7與甲烷桿菌屬中幾株菌的主要性狀比較。由表1可見，DL-7菌株與其他幾株在最適生長溫度及分離源上有較大差別。

圖3 溫度對菌株DL-7生長的影響Fig.3 Effect of temperate on the growth of strain DL-7.

圖4 pH對菌株DL-7生長的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of strain DL-7.

2.2.2生化特征

底物實驗結果表明，菌株DL-7只能利用H2/CO2為底物生長，不利用甲酸、甲醇、三甲胺、乙酸、乙醇等。

抗生素實驗的結果表明，菌株DL-7對紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、利福平等抗生素均有抗性，對氯霉素敏感。

表1 DL-7與幾株熱自養產甲烷菌主要性狀的比較Table 1 Comparison between strain DL-7 and other most closely strains ofMethanothemobacter

圖5 不同鹽濃度對菌株DL-7生長的影響Fig.5 Effect of salinities on the growth of strain DL-7.

表1是DL-7菌株與幾株熱自養甲烷菌主要性狀的比較。由表1可見，DL-7菌株與其他幾株在最適生長溫度、最適pH值、分源等有明顯的不同。

2.3 16S rRNA序列的測定及系統發育樹構建菌株

菌株DL-7 的 16S rRNA 部分序列長 958 bp。根據菌株 DL-7 16S rRNA 測序結果進行 BLASTn分析，菌株 DL-7與M. marburgensisDSM 2133T(X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%。菌株 DL-7 與嗜熱產甲烷桿菌屬其他菌株的系統發育分析結果見圖6。

圖6 基于16S rRNA序列相似性構建的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences.

3 討論

雖然DL-7的16S rRNA與M. marburgensisDSM 2133T的相似性高達99.7%，但是二者在部分生理生化特征和G+C含量2個指標上還是有較大差異。其確切分類地位還有待用 DNA分子雜交[12]的技術手段作進一步的鑒定。

高溫油藏環境經歷了漫長的地質年代的演化過程，作為一個典型的高溫高壓高礦化度的極端厭氧環境，其內部的微生物菌群結構和物質能量的代謝方式必然有其特殊性。產甲烷菌處于油藏厭氧環境中物質代謝的最后控制環節，它的生長特性必然影響著整個物質傳遞鏈中各類菌群的代謝生長，同時產甲烷古菌的生長也必然受控于其上游整個菌群的生長代謝。因此，分離和研究高溫油藏中產甲烷古菌的代謝特征對我們認識油藏環境中整個物質能量代謝特征有極其重要的意義。

產甲烷古菌以其特殊的代謝方式參與地球生物圈中的碳素循環，其代謝產物甲烷既是導致全球氣候變暖的第二大溫室氣體[13]，同時又是最有前景的可再生新能源載體之一。探索研究產甲烷菌的進化歷史、分布范圍和代謝特征，已經成為地球化學、環境化學、生物化學和微生物學等多學科交叉的研究熱點。

高溫沼氣發酵工程作為人工控制的高溫厭氧產甲烷代謝體系，與高溫油藏厭氧發酵具有很多相似之處。在高溫沼氣發酵過程中，產甲烷菌群無疑是整個發酵代謝中最為重要的一環，它們控制著整個代謝過程的速率。目前分離自高溫人工厭氧生物反應器的產甲烷古菌很大一部分屬于嗜熱產甲烷桿菌屬，通過對該類產甲烷菌群的研究有助于我們對整個高溫產甲烷發酵體系的認識，從而更好指導我們對高溫產甲烷發酵工程的設計、調試和運行。

REFERENCES

[1] Ueno Y, Yamada K, Yoshida N,et al.Evidence from fluid inclusions for microbial methanogenesis in the early Archaean era.Nature, 2006, 440: 516?519.

[2] Jones DM, Head IM, Gray ND,et al.Crude-oil biodegradation via methanogenesis in subsurface petroleum reservoirs.Nature, 2007, 451: 176?180.

[3] Cheng L, Qiu TL, Yin XB,et al.Methermicoccus shengliensisgen. nov., sp. nov., a thermophilic,methylotrophic methanogen isolated from oil-production water, and proposal ofMethermicoccaceae fam. nov..Int J Syst Evol Microbiol, 2007, 57: 2964.

[4] Cheng L, Qiu TL, Li X,et al.Isolation and characterization ofMethanoculleus receptaculisp. nov.from Shengli oil field, China.FEMS Microbiol Lett, 2008,285: 65?71.

[5] Zeikus JG, Wolee RS.Methanobacterium thermoautotrophicussp. n., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile.JBacteriol, 1972, 109: 707.

[6] Wasserfallen A, Nolling J, Pfister P,et al.Phylogenetic analysis of 18 thermophilicMethanobacteriumisolates supports the proposals to create a new genus,Methanothermobactergen. nov., and to reclassify several isolates in three species,Methanothermobacter thermautotrophicuscomb. nov.,Methanothermobacter wolfeiicomb. nov., andMethanothermobacter marburgensissp. nov..Int J Syst Evol Microbiol, 2000, 50: 43.

[7] Balch WE, Wolfe RS. New approach to the cultivation of methanogenic bacteria: 2-mercaptoethanesulfonic acid(HS-CoM)-dependent growth ofMethanobacterium ruminantiumin a pressureized atmosphere.Appl Environ Microbiol, 1976, 32: 781.

[8] Romesser JA, Wolfe RS, Mayer F,et al.Methanogenium,a new genus of marine methanogenic bacteria, and characterization ofMethanogenium cariacisp. nov. andMethanogenium marisnigrisp. nov..Arch Microbiol,1979, 121: 147?153.

[9] Qiu TL, Cheng L, Luo H,et al.Isolation and characterization of methanogens from sediments in Jiaozhou Bay.China Biogas, 2007, 25: 3?6.

仇天雷, 承磊, 羅輝,等.一株近海沉積物中產甲烷菌的分離及鑒定. 中國沼氣, 2007, 25: 3?6.

[10] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.Mol Biol Evol, 1987, 4: 406.

[11] Mandel M, Marmur J. Use of ultraviolet absorbance-temperature profile for determining the guanine plus cytosine content of DNA.Methods Enzymol,1968, 12: 195?206.

[12] Gonzalez JM, Saiz-Jimenez C. A simple fluorimetric method for the estimation of DNA?DNA relatedness between closely related microorganisms by thermal denaturation temperatures.Extremophiles, 2005, 9: 75?79.

[13] Ren R. Man-made sources of methane emissions and technologies for reducing methane emissions.Environment Herald, 2000, 4: 42?43.

任仁. 溫室氣體甲烷的人為源及其減排的技術措施. 環境導報, 2000, 4: 42?43.

Isolation and identification of a methanogen from the high temperature oil reservoir water

Haichang Liu1, Guihong Lan2, Quanquan Liu1, Wenjing Zhang1, Yi Cao2, Yu Deng1,and Hui Zhang1

1Key Laboratory of Energy Microbiology and Application,Chengdu610041,China
2School of Life Science,Sichuan University,Chengdu610065,China

Received:May 22, 2010;Accepted:July 6, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 40973059).

Corresponding author:Hui Zhang. Tel/Fax: +86-28-85258573; E-mail: zhanghuits@yahoo.com.cn

國家自然科學基金 (No. 40973059) 資助。