反式白藜蘆醇對Aβ25-35致癡大鼠海馬誘導型一氧化氮合酶表達的影響

王順旺,徐 平,劉海軍,陳 群,劉艷芳,張 麗,龔其海,李 彬

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州遵義563003;2.廈門第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,福建廈門361100;3.復旦大學藥學院醫(yī)理系,上海200433)

國內(nèi)外對體外中樞神經(jīng)元損傷保護和人為損傷單側(cè)大鼠海馬建模的研究已經(jīng)開展較多,而使用顱鉆鉆孔微注棒Aβ25-35注射損傷雙側(cè)大鼠海馬和反式白藜蘆醇(trans-resveratrol,TR)保護海馬組織的動物研究目前較少開展。動物實驗表明,反式白藜蘆醇葡糖苷(trans-resveratrol-3-O-glucoside,TRG)在防止動脈內(nèi)皮損傷性血栓形成,改善休克微循環(huán),提高休克大鼠存活率,減輕缺血再灌注、自由基和內(nèi)毒素造成的組織器官損傷,降血脂及抗脂質(zhì)氧化和抗血小板聚集等方面具有良好的作用[1-4]。腸黏膜在 TRG脫糖代謝中起著非常重要的作用,TR主要在腸黏膜代謝,灌胃給藥吸收好,推測TRG的脫糖代謝與黃酮苷類化合物類似,也是在大鼠腸黏膜中β2葡糖苷酶的催化下進行的[5],所以選擇灌胃給藥。本研究通過觀察使用TR來干預癡呆大鼠模型的效果,以探求臨床上癡呆患者理想藥物治療的實驗研究方法。

1 材料與方法

1.1 藥物 TR粉劑(淡黃色),購自天津游龍發(fā)展有限公司。苦味酸購自生工生物工程(上海)有限公司,Aβ25-35購自SIGMA公司(Amyloidβ-Protein Fragmene 25-35批號:A4559),RNAiso Regent液、逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光液Green Supermix等PCR試劑購自大連寶生物公司。iNOS優(yōu)化引物由本院藥理系美籍客座教授劉杰博士贈送。

1.2 儀器 冷凍離心機(德國5417R)、紫外可見分光光度計(TU-1810)、多功能梯度 PCR儀(德國22331)、實時熒光定量PCR儀(美國 Icycler IQ)、雙臂腦立體定位儀(68002型 RWD life science co)、顱鉆(78001型)、超微量注射棒、Morris水迷宮(MWM)等。

1.3 方法

1.3.1 分組及制模 制模選用重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供的SPF級SD雄性大白鼠 65只,體質(zhì)量為 300～350 g[許可證號scxk(渝)2007-0005]。MWM訓練3 d成績穩(wěn)定后,剔除逃避潛伏期小于5 s和大于50 s的大鼠,合格的60只隨機分為5組:假手術(shù)組(sham),模型組(model),TR 高、中、低劑量組。模型組及TR高、中、低劑量組制模。制模藥物 Aβ25-35在常溫下用生理鹽水溶解成濃度為1μg/μL溶液,在孵育箱中37℃孵育12 h后備用。取SD大鼠1只稱重,用5%水合氯醛0.7 mL/100 g麻醉。采用腹腔注射麻醉法,麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上,局部頭頂去毛、消毒,正中矢狀位切口,將骨膜分離、剝除,確定前、后囟,并使之處于同一水平面上,取前囟為0點,在前囟左、右側(cè)2.5 mm,后5.0 mm處用顱鉆鉆透顱骨,鉆孔直徑1 mm,自顱骨表面垂直進針于3.5～4.0 mm深處(此處為海馬所在部位),每側(cè)用微量加樣器加 10μL Aβ25-35溶液[6],每側(cè)注射結(jié)束后留針5 min,用牙托粉和 502膠混合物封閉鉆孔[7],縫合切口。假手術(shù)組給等體積的生理鹽水代替 Aβ25-35。

1.3.2 給藥 選用TR粉劑(淡黃色),用生理鹽水溶解成1%的TR溶液,制模結(jié)束大鼠清醒后開始灌胃給藥。TR高、中、低劑量組分別為 TR40、20、10 mg/(kg? d),假手術(shù)組、模型組給等體積的生理鹽水(NS,1 mL/100 g體質(zhì)量),共10 d。

1.3.3 行為學檢測 在制模后第11天開始采用MWM檢測大鼠的空間辨別學習記憶能力。檢測前1 d將大鼠置于無平臺的MWM 中2 min,使其知道無法逃避的水準,檢測的第1～4天進行定向航行實驗,第5天行空間搜索實驗。

1.3.4 取材 在制模后第11天每組取大鼠7只經(jīng)10%水合氯醛(0.8 mL/100 g)麻醉,斷頭取腦,切取雙側(cè)海馬組織放入加有0.5 m LRNA萃取液的Ep管中,-80℃速凍備檢測。

1.3.5 RT-PCR法檢測大鼠海馬iNOS的表達 (1)RNA提取。①勻漿:取冷凍于0.5 m L RNAiso Regent液的大鼠海馬及其周邊皮質(zhì)樣本,研磨杵充分勻漿;②萃取:0.5 mL勻漿加氯仿0.5 m L,快速搖勻,離心12 000 r/min,4℃,10 min,取出上清液并定量;③沉淀:加等量于上清液樣的異丙醇,離心12 000 r/min,4℃,10 min,棄去上清液;④清洗:加入 75%的乙醇0.5 mL,12 000 r/min,4℃,7 min,小心棄去乙醇上清液;⑤空干:濾紙上倒置;⑥溶解:焦碳酸二乙酯(DEPC)水 50μL溶解。(2)RNA純化、純度和含量測定、逆轉(zhuǎn)錄及擴增按文獻[8]及試劑盒說明書進行,但所加入的引物不同。目的基因表達的相對定量法:以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct值)為統(tǒng)計參數(shù),依次計算下列數(shù)據(jù),Ct值的平均值=(Ct1+Ct2)/2(重復管);dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值);基因的表達=2-d Ct。

1.3.6 原位末端標記(TUNEL)法檢測 TUNEL法檢測大鼠海馬細胞凋亡情況:海馬標本制成石蠟包埋塊,切片(經(jīng)前聯(lián)合冠狀切片厚6μm),用防脫載玻片制作石蠟切片病理標本,脫蠟水化,PBS沖洗 2次(每次 3 min,下同)。在 0.1%TrionX-100枸櫞酸鈉滲透液冰上(2～8℃)孵育 8 min,PBS沖洗2次。擦干組織周圍水分,每片加50μL TUNEL反應液(新鮮配制,取 Enzyme Soultion液1份加入 Label solution液 9份混勻離心,冰浴備用。陰性對照2張片子不用TUNEL反應液,只加50μL Label solution液)于濕化盒中37℃、避光孵育 60 min,PBS沖洗3次。擦干組織周圍水分,嚴格按照Roche公司試劑盒說明書操作,采用DAB顯液,光鏡下觀察陽性細胞核呈棕黃色顆粒狀,凋亡細胞的細胞核染色質(zhì)為新月型或蠶豆狀棕黃色濃染,并可見核碎裂小體。在高倍鏡下(×400)下計算凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI),即每張片選取不重疊10個細胞數(shù)最多的高倍視野計算出每個視野中凋亡細胞與總細胞數(shù)的百分比,計算8個視野的平均凋亡細胞百分數(shù)及平均凋亡細胞百分數(shù)(每組7個樣本切片)。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較用單因素方差分析結(jié)合LSD檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MWM結(jié)果 逃避潛伏期是檢測大鼠學習記憶一個重要指標,是實驗室常用的行為學檢測指標,正常大鼠一般在12 s以內(nèi),本實驗第1～4天定位航行實驗的逃避潛伏期(s)依次是:假手術(shù)組4 d檢測的均值分別為(8.86±3.26)s、(7.87±2.72)s、(6.89±3.71)s、(5.39±3.11)s;模型組 4 d 檢測的均值分別為(80.59 ±22.73)s、(79.58 ±28.91)s、(60.01 ±25.89)s、(57.63±20.67)s;TR高劑量組檢測的均值分別為(13.67±3.71)s、(10.68±2.76)s、(12.36±5.95)s、(10.50±3.67)s;TR中劑量組檢測的均值分別為(19.37±11.76)s、(21.28±5.46)s、(17.38±6.71)s、(28.99±5.02)s;TR 低劑量組檢測的均值分別為(40.82±13.21)s、(45.26±11.70)s、(36.97±6.71)s、(32.66±7.83)s。上面數(shù)據(jù)表明,TR對海馬內(nèi)注射Aβ25-35所致大鼠學習記憶減退的影響是明顯的(封2圖1、2),TR高劑量組和模型組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TR高劑量組和 TR中劑量組組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05,圖3),低劑量組和模型組及低劑量組和TR高劑量組、TR中劑量組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 假手術(shù)組、模型組及TR高、中、低劑量組中PCR法檢測各組iNOSm RNA表達分別為0.23±0.90、1.23±0.91、0.34±0.18、0.48±0.12、0.87±0.49。 TR對海馬內(nèi)注射Aβ25-35大鼠的海馬iNOS m RNA在各組表達的影響,見圖3。TR高劑量組表現(xiàn)為iNOS mRNA表達減少,其與模型組的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖3 TR對癡呆大鼠海馬iNOS的m RNA表達的影響

2.3 TUNEL法檢測結(jié)果 TUNEL法檢測大鼠海馬組織每個視野的假手術(shù)組、模型組及TR高、中、低劑量組的凋亡細胞百分比第11天分別為:(3.23±0.52)%、(21.32±5.02)%、(5.72±1.56)%、(7.21±1.22)%、(10.93±3.25)%;術(shù)后第17天分別為:(3.21±0.29)%、(16.31±4.27)%、(5.13±2.00)%、(7.12±1.78)%、(9.84±2.66)%。TR對海馬內(nèi)注射Aβ25-35大鼠的海馬細胞凋亡的影響(封 2圖 4,圖 5,表 1)。假手術(shù)組凋亡細胞百分明顯低于模型組的凋亡百分比,TR高劑量組和模型組凋亡百分比的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表 1 TUNEL法測 TR對 Aβ25-35致癡呆大鼠腦細胞凋亡的影響

圖5 TUNEL法檢測TR干預對癡呆大鼠海馬細胞凋亡的影響結(jié)果折線圖

3 討 論

實驗設(shè)計分析如下:白藜蘆醇(resveratrol,Res)是虎杖中有效成分,中藥虎杖中的Res含量最高 。Res藥理作用廣泛,主要包括:抗氧化、清除自由基、神經(jīng)保護、抗炎等作用,對機體損傷的保護作用、植物雌激素作用及對骨代謝的影響等。其神經(jīng)保護作用表現(xiàn)在體外(離體情況)抑制Aβ的聚集[9]。Res包括順式Res和TR,研究表明 TR有抗氧化、清除自由基、神經(jīng)保護等作用,TR活性較順式Res活性高,能夠通過血腦屏障。而本課題的前期體外實驗也發(fā)現(xiàn)Res對原代培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖缺失損傷的保護[10],所以選用TR作為干預藥是前期課題的研究延伸。本課題組在研究銀杏葉提取物減輕緩激肽誘導的大鼠記憶減退中已得出,減輕大鼠學習記憶減退可能與實驗用藥抑制海馬caspase-3和caspase-8 mRNA表達有關(guān)。國內(nèi)研究表明,大鼠學習和記憶功能下降與NOS過度表達引起的神經(jīng)毒性作用有關(guān)。通過抑制神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS的活性或表達的藥物可以起到神經(jīng)保護作用,改善了大鼠的學習和記憶功能[11]。而能明顯抑制脂多糖(LPS)引起的腦細胞炎癥反應的藥物也可以通過下調(diào)iNOS的表達起到保護腦細胞的作用[12]。Aβ25-35對海馬的毒副作用會引起iNOS的過度表達及激活,從而產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)。本實驗選用iNOS優(yōu)化引物主要因為iNOS的表達是和促凋亡蛋白激酶、caspase-3的活動是相關(guān)的[13],用優(yōu)化的iNOS引物作為觀測指標目的是起到替代caspase-3引物的作用,甚至有可能通過檢測其表達來說明TR起到iNOS抑制劑作用,能減輕Aβ25-35對海馬細胞的毒害作用,進而更好說明TR對癡呆模型大鼠的保護作用。

本實驗采用顱鉆雙側(cè)顱頂鉆孔造模,用Aβ25-35破壞雙側(cè)大鼠海馬起到很好致癡呆作用(海馬在學習和記憶中起著重要的作用,所以本實驗選海馬細胞凋亡程度作為造模成功指標之一)。而選用10 d灌胃法是在既往研究基礎(chǔ)上得出,本實驗與前人造模實驗有一致性,即術(shù)后1周左右模型組凋亡細胞比假手術(shù)組明顯增多[7]。制模后模型組大鼠可以觀察到:行動遲緩、活動減少、反應遲鈍、神情淡漠等臨床神經(jīng)行為學改變,水迷宮結(jié)果(封2圖1、2)表明模型組與假手術(shù)組差異明顯(P＜0.01),結(jié)合前文的病理圖片(封2圖4中B所示)可見造模后模型組大鼠海馬區(qū)出現(xiàn)變性壞死神經(jīng)元,神經(jīng)元存活數(shù)目減少,以上說明造模成功。本文特意做了灌胃10 d((術(shù)后第11天)和(術(shù)后第17天)病理比較,從表1和圖5的統(tǒng)計學分析得出實驗灌胃10 d和灌胃16 d差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),從而得出灌胃10 d可能是合理的。從PCR檢測iNOS的m RNA的表達結(jié)果統(tǒng)計分析可得出,TR對iNOSmRNA表達水平的下調(diào)在假手術(shù)組與模型組;TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),TR高劑量組與低劑量組之間比較差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01,圖3)。從圖5得出各劑量干預組的組織病理改變較模型組在術(shù)后第11天和術(shù)后第17天均有不同程度的改善。假手術(shù)組與高劑量組相比逃避潛伏期、iNOSmRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖2、3),表明高劑量組治療效果可能接近正常水平。總之以上說明TR在本實驗中對癡呆大鼠的干預是有效,而且與劑量有關(guān)。實驗結(jié)果表明:TR對Aβ25-35引起的腦細胞的炎癥及凋亡反應有抑制作用,從而說明TR對海馬損傷模型大鼠可能起部分保護作用,其機制可能與其抑制Aβ25-35引起的炎癥反應、下調(diào) iNOS表達、減輕神經(jīng)元的損傷有關(guān)。

(志謝:本實驗得到本院“貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室”的神經(jīng)藥理課題組大力幫助,感謝劉杰博士、吳芹高級技師的指導)

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