腎舒顆粒(無糖型)質量標準研究

陳海濱

(福建省藥品檢驗所,福建 福州 350001)

腎舒顆粒(無糖型)質量標準研究

陳海濱

(福建省藥品檢驗所,福建 福州 350001)

目的：建立腎舒顆粒的質量標準。方法：用TLC對處方中白花蛇舌草、大青葉、甘草、黃柏進行定性鑒別；用HPLC測定黃柏中鹽酸小檗堿的含量。結果：定性鑒別分離度好，專屬性強。含量測定鹽酸小檗堿在0.01～1.28μg具有良好的線性關系,r=0.999 9。結論：該方法簡便、準確，重復性好，可用于腎舒顆粒(無糖型)的質量控制。

腎舒顆粒；白花蛇舌草；大青葉；甘草；黃柏；鹽酸小檗堿

腎舒顆粒由白花蛇舌草、大青葉、瞿麥、萹蓄、海金沙藤、淡竹葉、地黃、黃柏、茯苓、甘草等10味中藥組成。具有清熱解毒，利水通淋功能，用于尿道炎，膀胱炎，急慢性腎盂腎炎。腎舒顆粒全國共有4個生產批準文號，3家企業生產，原標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第9冊(標準編號：WS3-B-1752-94),僅有兩個化學鑒別項。本次研究購得兩個企業、不同批號的無糖型樣品多批，力爭用同一標準更好控制同一成藥質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-2010CHT高效液相色譜儀，包括真空脫氣機，四元梯度泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器，LC Solution工作站，Milli-QA 超純水器(Millipore)。

1.2 試藥

腎舒顆粒(無糖型)(廈門中藥廠，批號080401，080402，080501；四川迪康科技藥業股份有限公司成都迪康制藥公司，批號071003，071004，071101)；缺白花蛇舌草、缺大青葉、缺甘草、缺黃柏的陰性對照品(廈門中藥廠)。

白花蛇舌草對照藥材(批號121183-200402)，甘草對照藥材(批號120904-200512)，關黃柏對照藥材(批號120937-200506)，黃柏對照藥材(批號121510-200703)，齊墩果酸對照品(批號110709-200505)，靛玉紅對照品(批號0717-9402)，鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200609)，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 白花蛇舌草、甘草薄層鑒別

取本品10g，加甲醇80mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL、鹽酸1mL，超聲使溶解，置水浴上加熱回流1h，取出，冷卻，用二氯甲烷振搖提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取白花蛇舌草、甘草對照藥材各1g，分別加甲醇25mL，同法制備，殘渣分別加甲醇2mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。取缺白花蛇舌草、缺甘草兩種陰性腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法制成陰性對照品溶液。吸取供試品溶液4～8μL，對照品及對照藥材溶液各4μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G預制薄層板上，使成條狀，以甲苯-醋酸乙酯-醋酸(48∶16∶2)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與甘草對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的條斑；置紫外燈(365nm)下檢視，在與齊墩果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光條斑，見圖1。

A.日光 B.紫外光燈(365nm)1.缺甘草腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 2.甘草對照藥材(批號120904-200512) 3～5.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 6～8.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101) 9.缺白花蛇舌草腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 10.白花蛇舌草對照藥材(批號121183-200402) 11.齊墩果酸對照品(批號110709-200505)圖1 腎舒顆粒中白花蛇舌草、甘草薄層色譜鑒別

2.2 大青葉薄層鑒別

取本品20g，研細，加甲醇80mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30mL，超聲使溶解，用二氯甲烷振搖提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取靛玉紅對照品，加二氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺大青葉的腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)為展開劑，展開，展距約5cm，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖2。

1.靛玉紅對照品(批號0717-9402) 2.缺大青葉腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 3～5.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 6～8.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101)圖2 腎舒顆粒中靛玉紅薄層色譜鑒別

2.3 黃柏薄層鑒別

分別取關黃柏、黃柏對照藥材各0.5g，加甲醇10mL，加熱回流15min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺黃柏的腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法，制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取對照品及對照藥材溶液各2μL，陰性對照品及“2.2項下”的供試品溶液1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，分別以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖3。

1～3.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101) 4～6.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 7.缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 8.關黃柏對照藥材(批號120937-200506) 9.黃柏對照藥材(批號121510-200703) 10.鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200610)圖3 腎舒顆粒中黃柏薄層色譜鑒別

3 含量測定

3.1 色譜條件和測定方法

采用Welch Materirals XB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以0.033mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(72∶28)為流動相；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1，測定波長：265nm；進樣量(自動進樣)：供試品溶液20μL，對照品溶液10μL。

3.2供試品溶液制備

取研細的樣品0.3g，精密稱定，精密加入流動相25mL，稱重，超聲提取20min(功率300W，頻率40kHZ)，放冷至室溫，用流動相補足減失的重量，濾過，取續濾液，即得。

3.3 對照品溶液制備

取經105℃干燥5h的鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加流動相配制成每1mL約含0.01mg的溶液，即得。

3.4 線性關系考察

精密稱取105℃干燥5h的鹽酸小檗堿對照品適量，加流動相溶解，制成對照品母液(0.128 1mg·mL-1)，分別精密吸取0.4，2，5，10，25，50mL，置50mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積與對照品進樣量(μg)進行回歸，得線性方程Y=4 434 060.30X-16 312.44(r=0.999 9)，線性范圍為0.01～1.28μg。

3.5 專屬性試驗

取缺黃柏陰性樣品0.3g，按供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液，測定，結果見圖4，缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品溶液在與對照品相應的保留時間處無峰出現，表明方中其他各味藥材不干擾鹽酸小檗堿的測定。

A.鹽酸小檗堿對照品 B.腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401) C.缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品圖4 鹽酸小檗堿對照品、腎舒顆粒(無糖型)及缺黃柏陰性樣品HPLC圖

3.6重復性試驗

取腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401)，按供試品溶液提取方法平行制備6份，依上述色譜條件進行測定并計算鹽酸小檗堿的含量，平均含量為3.94mg/袋，RSD=1.89%(n=6)。

3.7 耐用性試驗

3.7.1 穩定性試驗 取供試品溶液在0，4，8，12，16，20，24h后按上述色譜條件測定樣品中鹽酸小檗堿峰面積，結果RSD=0.40%。

3.7.2 在一定范圍內改變流動相比例對色譜圖的影響 選用Welch Materirals XB-C18色譜柱試驗，分別采用流動相乙腈-0.033mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(26∶74)、(28∶72)、(30∶70)，結果鹽酸小檗堿峰與相鄰的雜質峰均能達到良好的分離，見圖5。

3.7.3 不同品牌色譜柱對實驗的影響 選用Welch Materirals XB-C18色譜柱，SHIMUDZU島津柱子，對同一份供試品溶液，按上述色譜條件進行含量測定，結果樣品與對照品均獲得良好的峰形，見圖6，鹽酸小檗堿平均含量為0.37mg·g-1，RSD=1.68%。

3.7.4 不同儀器對實驗的影響 選用同一色譜柱Welch Materirals XB-C18色譜柱，對同一份供試品溶液，分別在島津2010CHT高效液相，Agilent 1100液相，按正文色譜條件進行含量測定，結果樣品與對照品均獲得良好的峰形，見圖7，平均含量0.38mg· g-1，RSD=1.36%。

圖5 不同比例流動相的HPLC圖A.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(26∶74) B.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(28∶72) C.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(30∶70)

A.Welch Materirals XB-C18 B.SHIMUDZU島津柱子圖6 不同品牌色譜柱HPLC圖

A.島津2010 CHT B.Agilent 1100圖7 同一品牌色譜柱不同儀器HPLC圖

3.8 加樣回收率試驗

取已知含量(0.392mg·g-1,3.94mg/袋)的腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401)9份，每份約0.15g，采用加樣回收，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.012 6mg·mL-1)4,5,6mL，按供試品溶液方法，每個梯度平行制備3份，測定，結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗

3.9 樣品含量測定

取6批樣品按上述色譜條件，測定鹽酸小檗堿含量，結果見表2。

表2 腎舒顆粒(無糖型)鹽酸小檗堿的含量測定 mg/袋(mg·g-1)

4 討論

4.1 薄層色譜鑒別

2.1項下白花蛇舌草薄層色譜鑒別中，廈門中藥廠生產的腎舒顆粒(無糖型)斑點顏色明顯比四川迪康科技藥業股份有限公司成都迪康制藥公司的清晰，通過對二者制法的比較，估計與兩藥廠醇沉密度不同所致，該步驟有可能使兩家藥廠所生產出的腎舒顆粒在含量上有所不同。

黃柏、關黃柏薄層的鑒別中，黃柏為常用皮類藥材，有關黃柏與川黃柏之分，近來研究發現，黃柏與關黃柏不僅其主要有效成分小檗堿含量有明顯差異，而且輔助成分黃柏堿等也存在較大差異[1-3]，為確證處方所用為關黃柏還是川黃柏，采用中國藥品生物制品檢定所提供的兩個對照藥材進行試驗，同時具有大小相近的鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的兩個黃色熒光斑點的是關黃柏；只有鹽酸小檗堿的黃色熒光斑點，或雖然有鹽酸巴馬汀黃色熒光斑點，但極小或隱約可見的是黃柏[4]。在同一張薄層板上，相同取樣量的黃柏與關黃柏的鹽酸小檗的黃色熒光斑點，前者明顯比后者大而且亮[5]，結果兩個生產企業所用均為川黃柏。

白花蛇舌草為處方中君藥，在【含量測定】指標成分選擇中曾擬對其進行含量測定的考察。查閱大量參考文獻[6-9]，白花蛇舌草中含豆甾醇、谷甾醇、熊果酸、齊墩果酸、香豆酸等成分。國外報道其中還含有蒽醌類、環烯醚萜類成分。僅熊果酸、齊墩果酸有中國藥品生物制品檢定所提供對照品。因此對該兩種成分進行含量測定摸索。先用薄層法進行預試，供試品溶液未經過酸水解時，四川迪康科技藥業股份有限公司成都迪康制藥公司的樣品未能檢出齊墩果酸、熊果酸，只有經過酸水解后，兩個生產企業樣品可檢出齊墩果酸。但考慮該兩個成分非白花蛇舌草獨有成分，在中藥材中非特征性成分，且需酸水解后測定，缺乏一定的專屬性，故只對該藥材進行薄層色譜鑒別。

4.2 流動相選擇

采用《中國藥典》黃柏藥材[10]液相條件：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)，結果鹽酸小檗堿峰與雜質峰分離較差。用HPLC測定鹽酸小檗堿含量所用的流動相有多種[11-15]，摸索用乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氫鉀、乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氫鉀(43∶57)(每1 000mL中加入十二烷基磺酸鈉1.7g)，0.033mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(60∶40)，乙腈-磷酸二氫鈉(0.025mol·L-1)-十二烷基硫酸鈉(0.025mol·L-1)(50∶25∶25)，乙腈-水(每 100mL加 0.26mL磷酸、0.5mL三乙胺與0.05g十二烷基硫酸鈉)(46∶54)等5種流動相，結果選用0.033mol· L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(60∶40)，系統適用性較好，且配制簡便。

4.3 鹽酸小檗堿轉移率

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StudyonQualitySpecificationofShenshuGranule

Chen Haibin

(Fujianinstitutefordrugcontrol，FuzhouFujian350001,China)

Objective:To establish the quality standard for Shenshu Granule.Methods:HedyotisdiffusaWilld.,IsatisindigoticaFort.,Glycyrrhiza,PhellodendronchinenseSchneid. in Shenshu Keli were identified by TLC. The content ofPhellodendronchinenseSchneid.was determined by HPLC.Results: The study showed that the dentification by TLC was distinct and highly specific. The linear range of berberine hydrochloride was 0.01～1.28μg(r=0.999 9).Conclusion: The method for identification was simple, accurate, realizable and reproducible. It can be used for quality control of Shenshu Keli.

Shenshu Granule；HedyotisdiffusaWilld.；IsatisindigoticaFort.；Glycyrrhiza；PhellodendronchinenseSchneid.；Berberine Hydrochloride

*陳海濱，E-mail：chenhaibin1997@126.com

2010-03-24)