一株耐高溫無機磷降解菌解磷能力的研究

胡春明，姚 波，席北斗，魏自民，趙 越*，胡德勝

（1.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國環境科學研究院水環境系統工程研究室，北京 100012；3.北京師范大學環境學院，北京 100876；4.哈爾濱工程大學水聲工程學院，哈爾濱 150001）

在農業種植方面，磷是植物必需的營養元素之一，大多數耕地土壤中磷素的95%與Fe、Ca和Al等結合成無效態磷，植物難以直接吸收利用，導致全國有74%的耕地土壤缺磷[1]。我國的農用磷肥主要是磷礦粉經加工而成[2]，但其中也有相當一部分為無效態磷，如直接施用，肥效受許多因素限制[3-4]。而解磷微生物可以通過活化難溶磷促進植物生長[5]。近年來的堆肥試驗表明，在添加難溶性磷礦粉的堆肥中接種適合堆肥環境的耐高溫解磷微生物，能夠加快堆料中難溶性磷的轉化，獲得富磷生物有機肥[6-7]。因此，為提高堆肥中難溶性無機磷的轉化效率，篩選、馴化適合于堆肥環境的高溫無機磷降解微生物逐漸引起研究者的重視[8-9]。隨著對解磷微生物研究的深入，有較多的解磷菌被報道，但大多是一些常溫菌，不適合于堆肥復雜的高溫環境。本研究采用課題組從高溫堆肥樣品中篩選得到的1株耐高溫無機磷降解菌株，結合不同因素水平的正交試驗設計，闡明各因素水平對其解磷能力的影響，進而為其在實際堆肥中的應用與推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

高溫無機磷降解菌：霉菌，由東北農業大學生命科學學院微生物學實驗室提供。耐受溫度范圍廣（35～50℃），解磷能力強。

1.1.2 磷礦粉

磷礦粉：總磷16.56%；速效磷（檸檬酸-P）3.55%；水溶性磷0.25%，取自貴州某磷礦廠。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 無機磷固體培養基

用于對菌種活化，難溶性磷礦粉為其中唯一磷源。葡萄糖 10 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷礦粉5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，瓊脂粉 18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.2 種子培養基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，KH2PO45 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.3 發酵培養基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷礦粉添加量見表1，分別按4、5、6、7 g·L-1的水平數進行，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

本試驗采用正交設計軟件（正交設計助手ⅡV3.1），將發酵溫度、培養時間、磷礦粉添加量及菌劑接種量作為優化因素，選定L16（45）正交表，并安排一個空列填充因素數。

1.2.2 菌株的活化

將供試菌株用無機磷固體培養基進行斜面劃線，按表1中相應的溫度水平在培養箱里培養，活化菌種。

表1 正交設計因素及水平Table1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.3 種子液制備

將1.2.2中活化好斜面保藏的解磷菌株，接種于種子培養基中，解磷菌按表1中相應的溫度水平，120 r·min-1，搖床培養 72 h，菌種量 108cfu·mL-1，備用。

1.2.4 發酵培養處理

將種子液按表1中的接種量水平接種至發酵培養基中，120 r·min-1條件下搖床培養，培養時間和溫度均按照表1中的水平進行，并以接滅活菌為對照組，對可溶性磷及微生物量磷等相關指標進行分析測定，同時制作相應的磷標準曲線。

1.2.5 解磷量的測定

可溶性磷的測定：將發酵培養基于5 000 r·min-1離心10 min，取上清夜，鉬銻鈧比色法測定可溶性磷含量[10]。

微生物量磷的測定：將上述離心后所得的菌種，用無菌水反復沖洗、離心，洗去菌種表面粘附的發酵液，121℃滅活30 min，加6%的H2O25 mL，60℃水浴48 h以破壞菌體，釋放出微生物量磷，離心取上清液，釩鉬黃比色法測定微生物量磷[10]。根據如下公式計算解磷總量和無機磷降解率。

解磷總量（μg·mL-1）=可溶性磷量+微生物量磷

微生物解磷率（%）=[（接菌的發酵培養基中解磷總量-接滅活菌的發酵培養基的對照組中的解磷總量）/添加的磷礦粉中的總磷量]×100%

2 結果與分析

2.1 解磷總量的變化

2.1.1 解磷總量的直觀分析

結果見表2。當發酵液中磷礦粉添加量為7.0 g·L-1、高溫無機磷降解菌的接種量5 mL·L-1時，在45℃下培養22 d后，發酵液中解磷總量達到最大327.60 μg·mL-1。由于該組數據中磷礦粉的添加量為最大比例，而菌劑接種量則為最小比例，說明在本研究的接種范圍內，解磷量與解無機磷微生物的接種量沒有明顯的相關性。同時，在16組試驗數據之中，培養時間為22 d的條件下，其解磷總量都相對較大。

由表2可知，時間的極差值為156.607，對發酵液中解磷總量的影響最大，在磷成為微生物生長繁殖的限制因素時，培養時間的增加，微生物的解磷時間增加，結果也使得發酵液中總磷含量增加。溫度的極差值最小（10.167），這是由于該菌株的耐熱性范圍較廣，在35～50℃溫度范圍均具有較高的活性。發酵液中磷礦粉添加量的極差值也相對較小，這說明選擇4、5、6、7 g·L-1這個范圍的量添加磷礦粉，對解磷微生物的解磷能力影響不大。研究表明，在磷礦粉添加量達到15 g·L-1的情況下，會嚴重影響解磷菌的解磷環境，使得解磷能力嚴重降低。

表2 解磷總量的正交設計軟件分析Table2 Analysis of total soluble phosphorus by orthogonal design software

2.1.2 解磷總量的方差分析

圖1為經正交設計軟件分析出的F值，培養溫度的方差最小（0.019），主要是因為該菌的溫度耐受范圍較廣，在試驗設計的溫度范圍內（35～50℃）均具有很好的解磷能力；圖1中僅時間的F值（4.534）大于臨界值3.29，這與極差分析中時間對解磷量的影響最大相一致，同時說明該株菌的解磷總量在本研究限定的較窄的范圍內與溫度、添加磷礦粉的量及接種量等因素相關性不顯著。

2.2 微生物解磷率變化

2.2.1 微生物解磷率的直觀分析

本試驗供試菌株，在培養基中磷礦粉添加量、菌劑接種量分別為4 g·L-1和11 mL·L-1，50℃下培養22 d后，微生物的解磷率最大（37.55%），該組試驗中菌劑接種量最大。其次是培養條件為：磷礦粉添加量4 g·L-1，在接種9 mL·L-1的解磷菌后，于45℃下培養17 d后，無機磷的降解率達34.47%，解磷率也比較高。

正交軟件對微生物解磷率的分析結果見表3。時間對發酵液中微生物解磷率的影響最大，極差達17.412，這與發酵液中解磷總量分析相一致，培養時間的增加，使得解磷微生物對磷礦粉中的無機磷轉化時間增加，最終增加了解磷率。發酵液中菌劑接種量的極差最小（1.855），這是因為發酵過程中，解磷微生物能夠利用環境條件和自身的解磷能力迅速繁殖，說明菌劑接種量不是無機磷降解的限制因素。

表3 微生物解磷率的正交設計軟件分析Table3 Analysis of inorganic phosphorus-solubilizing ratio by orthogonal design software

2.2.2 磷礦粉降解率的方差分析

如圖2所示，時間的F值（3.55）大于臨界值3.29，說明發酵液培養時間與微生物的解磷率呈顯著相關性，這與極差分析中時間對解磷總量的影響最大相一致；因素中添加磷礦粉的量、溫度及接種量的F值均小于F臨界值，相關性不顯著，說明這些因素在本研究限定的范圍內不是該菌株解磷量和解磷率的主要限制因素。

3 討論與結論

由于在堆肥的過程中，溫度變化范圍較廣，分別經過升溫、高溫及降溫等過程。在堆肥周期內，堆料的溫度一般均保持30℃以上，因此，接種微生物在不同溫度水平下是否具有活性是其在堆肥中成功應用的關鍵因素。本試驗研究結果證實，在溫度為45℃培養條件下，培養時間22 d、磷礦粉添加量 7.0 g·L-1、菌劑接種量為 5 mL·L-1，發酵液中解磷總量達到最大值（327.60 μg·mL-1）。不同因素水平條件下，溫度水平對試驗選取的解無機磷菌的解磷量及解磷率極差均較小，在培養溫度35～50℃條件下，解無機磷微生物均具有較高的解磷能力。本研究解無機磷微生物對溫度的耐受范圍分析結果也為其在堆肥中應用提供了依據，在實際接種堆肥過程中，除堆肥高溫期（>50℃）外，試驗采用的解無機磷菌株能夠適應堆肥過程中溫度變化，而堆肥的高溫期可以通過解無機磷微生物接種時間的控制加以避開，進而充分保持接種微生物的解磷活性。本試驗研究結果證實，培養時間是解無機磷微生物解磷量及解磷率的主要限制因素，說明隨著培養時間的延長，該解磷微生物可能通過自身的繁殖保持群落的穩定性，進而持續增加其對難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率，培養時間22 d后難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率可能會持續增加。但是，在一般情況下，采用反應器堆肥周期大都低于20 d，因此本試驗對于22 d后難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率未作進一步的研究。

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