熒光分光光度法測定大鼠不同腦區單胺類神經遞質

張 燕，王洪斌*，楊海霞，陳 清，趙 麗

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

單胺類神經遞質是中樞神經內重要的信息傳遞物質，參與鎮痛、軀體運動、精神情緒活動、睡眠、覺醒、應激等多種生理過程[1]，特別是對中樞神經系統的興奮或抑制起著協調作用[2-4]。本試驗根據去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）與氧化劑反應生成具有熒光的化合物，5-羥色胺（5-HT）在堿性條件下與OPT縮合形成具有熒光的化合物，上述熒光化合物強度與濃度成直線關系，即可通過測定其熒光強度而求得其濃度[5]，同時測定了大鼠不同腦區三種單胺類神經遞質，此方法檢測速度快，結果可靠。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年Wista大鼠，體重225±32 g，由黑龍江中醫藥大學提供，實驗動物許可證號為SCXK（京2007-0001）。

1.2 儀器

970CRT型熒光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；電子分析天平；玻璃勻漿器。

1.3 主要試劑及配制

標準品均購自美國Sigma公司：鹽酸去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE），批號為 74460；多巴胺（Dopamine，DA），批號為H8502；5-羥色胺（5-hydroxy-tryptamine，5-HT），批號為H7752。三種標準品以0.01 mol·L-1HCl分別配成濃度為1 g·L-1的儲備液，置4℃冰箱，臨用前用0.01 mol·L-1HCl稀釋定容至濃度為1.5 mg·L-1的混合標準溶液。

鄰苯二甲醛（O-phthaldialdenyde，OPT），分析純（批號061214），上海盈元化工有限公司。以10 mol·L-1HCl配制成0.004%的濃度，4℃儲存。

L-半胱氨酸（L-Cysteine），生化試劑（批號071008），上海惠世生化試劑有限公司。臨用前用0.1 mol·L-1HCl配制成1%的溶液。

堿性Na2SO3溶液（AR）：0.25 g Na2S03溶于9 mL 5 mol·L-1NaOH中，再加l mL水混勻，臨用前配制。

pH 7.0磷酸鹽緩沖液：貯藏液甲，7.1 g Na2HPO4溶于500 mL雙蒸水中；貯藏液乙，6.9 g NaH2PO4溶于500 mL雙蒸水中。甲、乙兩種液體貯于4℃冰箱中，臨用前取甲液32 mL，乙液68 mL，兩液混勻為pH 7.0的0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

酸性正丁醇：500 mL正丁醇（AR）中加濃鹽酸0.43 mL；正庚烷（AR）。

0.1 mol·L-1碘試液：KI 10 g溶于雙蒸水后，加入I22.5 g，再加雙蒸水至200 mL，貯于棕色瓶中，避光保存。

0.1 mol·L-1EDTA 溶液：取 EDTA-Na2·2H2O 3.71 g 溶于 95 mL NaAc（l mol·L-1）溶液加到 100 mL，貯于冰箱備用。

1.4 樣品預處理

大鼠斷頭處死，立即取腦組織，用冰生理鹽水沖洗后在生理鹽水冰面上迅速分離雙側大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干，分別稱重后立即-80℃冷凍保存。取大鼠腦組織置于玻璃勻漿器中，加少量冷酸化正丁醇，冰浴中勻漿，加冷酸化正丁醇至10倍量，3 000 r·min-1離心5 min。取上清液2.5 mL，加正庚烷5 mL、0.l mol·L-1HCl l.2 mL，漩渦振蕩 5 min，4 ℃離心（3 000 r·min-1，5 min），分離水相與有機相。

1.5 線性關系試驗

取混合標準溶液0、0.5、1、10、20、30、50、100、200、400 μL，分別加雙蒸水至 0.4 mL，依次加 pH 7.0磷酸鹽緩沖液 1.5 mL、0.1 mol·L-1EDTA溶液0.4 mL、碘試液0.1 mL，反應2 min，加堿性Na2SO3溶液0.4 mL，反應2 min，加6 mol·L-1HAc 0.4 mL，沸水浴2 min，迅速冷卻，于484/385 nm波長測定NE熒光強度，再將反應液沸水浴加熱20 min，移入冷水中冷卻，376/323 nm波長處測定DA熒光強度。

另取混合標準溶液0、0.5、1、10、20、30、50、100、200、400 μL，分別加雙蒸水至 0.4 mL，依次加入l%L-Cys 0.l mL、0.004%OPT-鹽酸溶液3 mL，0.02%NaIO4溶液0.l mL，沸水浴加熱10 min，迅速冷卻，于480/356 nm測定5-HT熒光強度。

1.6 重復性試驗

取同一份大鼠丘腦組織按上述試驗方法進行5次重復試驗。

1.7 回收率試驗

將一份已知濃度的丘腦組織勻漿液分成3份，分別加入等體積的低、中、高三種濃度的混合標準液，進行樣本提取并測定其熒光強度。

1.8 NE、DA和5-HT的提取與測定

取1.4處理后的水相0.4 mL，依照1.5的方法測定NE和DA熒光強度。

另取1.4處理后的水相0.4 mL，依照1.5的方法測定5-HT熒光強度。

1.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 線性關系

按1.5試驗步驟測樣，將測得的熒光強度值（Y）對標準品濃度（X）進行線性回歸，求得回歸方程Y=aX+b和相關系數R2，結果見表1。

結果表明，NE、DA和5-HT的熒光強度與其濃度呈直線關系，相關系數R2均達0.99，表現良好的線性關系。

表1 線性方程和相關系數Table1 Date for linear equation and correlation coefficients

2.2 重復性試驗

按1.6進行重復性試驗，結果測得NE、DA和5-HT含量的變異系數分別為7.6%、3.7%和7.5%，表明該檢測方法穩定、重現性好。

2.3 回收率試驗

按1.7進行試驗，結果見表2。

結果表明NE、DA和5-HT的平均回收率分別為102.2%、95.4%和102.8%，其回收率均在95%以上，表明該檢測方法可靠、檢出率較高。

2.4 大鼠不同腦區NE、DA和5-HT的含量

按1.8進行試驗，分別測定大鼠大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干中NE、DA和5-HT的含量，結果見表3。

表2 回收率試驗結果（，n=3）Table2 Results of recovery(,n=3)

表2 回收率試驗結果（，n=3）Table2 Results of recovery(,n=3)

表3 大鼠不同腦區NE、DA和5-HT的含量(，n=12）Table3 Contents of NE,DA and 5-HT in different encephalic regions in rat(,n=12)(ng·g-1)

表3 大鼠不同腦區NE、DA和5-HT的含量(，n=12）Table3 Contents of NE,DA and 5-HT in different encephalic regions in rat(,n=12)(ng·g-1)

結果表明，大鼠不同腦區NE、DA和5-HT的含量存在差異，在各腦區中，NE含量最高，DA含量最低。

3 討論與結論

3.1 腦組織的處理與腦分區

本試驗根據Welch的剪刀斷頭，直接取腦的方法[5]，按照腦的解剖結構劃分腦區，此法簡單迅速，鼠腦一般在30 s內可取出。取出的腦組織用冰生理鹽水沖洗后置于生理鹽水冰面上，不但使酶活性迅速降低，而且方便腦組織的分區。

3.2 試劑與振蕩方式

本文預試驗曾比較了重蒸與未重蒸正丁醇、正庚烷及手工劇烈振蕩5 min與旋渦振蕩30 s對提取過程的影響，結果發現所測單胺類物質的熒光強度無明顯差異，說明可直接使用分析純正丁醇和正庚烷，并可將手動劇烈振蕩5 min改為旋渦振蕩30 s，節省了時間與人力。在Shellenberger等[6]報道的方法中，正丁醇、正庚烷需重蒸，振蕩時間也較長。

3.3 樣品熒光的穩定性

本文預試驗曾將8份樣品發生熒光后4℃保存，于1、2、4、8、12、24、48和72 h分別測定其熒光強度，發現DA和5-HT熒光強度較穩定，但是NE熒光強度隨時間延長而減弱，因此建議樣品在發生熒光后應立即測定，尤其是NE需在1～2 h內完成，否則其熒光強度急速減弱。

3.4 最適反應條件

試驗結果表明，熒光強度隨著磷酸緩沖液pH增大而增強，在pH 6.5～7.5時熒光強度最大，本試驗選用pH 7.0；熒光強度隨著煮沸時間延長而下降，應將煮沸時間控制在20 min內；熒光強度隨著OPT濃度升高而降低，故選用0.004%的OPT測定5-HT。上述試驗條件與蔣曉玲、歐玉清等人選擇的試驗條件基本一致[7-10]。試驗所用試劑均為分析純，用雙蒸水配制，器皿用雙蒸水沖洗。

經典的單胺類物質熒光測定法程序繁瑣，條件復雜[6]，而高效液相色譜法雖然靈敏度高，但需要昂貴高效液相色譜儀，且易受其他物質的干擾等缺點。本文采用熒光分光光度法測定大鼠不同腦區NE、DA和5-HT的含量，試驗成本低、樣品處理量大，試驗結果表明，此方法靈敏度高、重復性好、結果可靠、簡便易行，可以為廣大醫務工作者和科研人員進行臨床監測及科學實驗提供參考。

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