山西省北冬蟲夏草優良菌株與母種培養基的篩選

程紅艷，郭 偉，常明昌,3，孟俊龍,3

（1.山西農業大學資源與環境學院，山西太谷030801；2.山西省食用菌工程技術研究中心，山西太谷030801；3.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

北冬蟲夏草又名北蟲草、蛹蟲草，屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）的模式種，學名為Cordyceps militaris[1]。北冬蟲夏草是一種珍貴的藥食同源大型真菌，在分類學上與冬蟲夏草同歸屬于蟲草屬，藥理作用與冬蟲夏草相似。由于野生蟲草資源極為有限，遠不能滿足日益增加的市場需求[2]。目前，人工栽培技術已獲得成功[3-6]。

本研究旨在馴化篩選培育出適合山西省乃至北方地區栽培的優良北冬蟲夏草菌種，為山西省工業化栽培生產北冬蟲夏草提供理論基礎和實踐依據[7]。

1 材料和方法

1.1 北冬蟲夏草優良菌株的篩選

1.1.1 供試菌株 1號菌株C1（吉林桑蠶研究所）；2號菌株C2（沈陽農科院）；3號菌株C3（山東夏津菌業）；4號菌株C4（華中農業大學菌種中心）。

1.1.2 試驗培養基 （1）斜面培養基：加富PDA培養基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，瓊脂 2%）。（2）一級液體種子培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨 1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%。（3）罐頭瓶栽培培養基：麥粒35 g+營養液50 mL（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，維生素 B10.01%）。

試驗前將引進的北冬蟲夏草母種活化，分別轉接到加富PDA培養基斜面上進行復壯和擴大培養。

1.1.3 試驗方法

1.1.3.1 拮抗試驗 采用加富PDA培養基。將4個供試菌株交叉配對接種于同一培養皿上，于25℃培養，觀察菌絲相接觸部分有無拮抗線，以鑒定是否存在重復菌株。

1.1.3.2 出草試驗

1.1.3.2.1 栽培步驟 （1）一級液體種子的制作：用250 mL的三角瓶裝100 mL一級種子培養基，于 0.098 MPa（1.0 kg/cm2）的壓力下，溫度 121 ℃，滅菌0.5 h，冷卻后接入復壯的母種（1支試管菌種接種5瓶），25℃恒溫振蕩暗培養5 d，待用。

（2）裝料與封口：以500 mL罐頭瓶為栽培容器，加入以麥粒為主的培養料和一定量營養液，用聚丙烯薄膜覆蓋瓶口，然后用橡皮筋套住封口。

（3）滅菌與接種：將裝料封口的罐頭瓶置于高壓鍋內，并在 0.147 MPa（1.5 kg/cm2）的壓力下，溫度129℃，滅菌2 h，冷卻至25℃左右時，接入一級液體菌種。接種量一般為每瓶10 mL。

（4）菌絲體培養：將接種后的罐頭瓶置于25℃的環境中進行絕對避光培養。

（5）誘導子實體形成：待菌絲體吃透培養基后，移入20～25℃的環境中進行光照培養，要求環境中光線充足，光線最好是從瓶的頂部射入，每天光照10 h以上，光強500 lx，當菌絲變為橘黃色時，在薄膜上扎小孔進行通氣，以保持濕度為70%～85%。

（6）采收：待子實體長到6～8 cm，其頂部出現許多小刺時，表明北冬蟲夏草已經成熟，即可采收。

1.1.3.2.2 試驗設計 將供試菌株按1.1.3.2.1栽培步驟進行瓶栽試驗，各菌株設置重復20瓶。栽培過程中，觀察和記錄出草時間、菌絲體長勢、子實體品質、產量和生物學效率。

1.2 北冬蟲夏草母種培養基的篩選

1.2.1 供試菌株 其為1.1中篩選的優良菌株。1.2.2 母種培養基 其組成成分如表1所示。

表1 5種母種培養基的組成成分 %

1.2.3 試驗方法 將1.1中篩選的最優北冬蟲夏草復壯菌株沿菌落邊緣切下0.5 cm2的菌塊，接種到待篩選的5種母種培養基試管斜面上。每一母種培養基接7管，25℃恒溫培養，定時觀察菌絲長勢（菌絲形態、色澤、密度），記錄滿管天數和平均生長速率。

2 結果與分析

2.1 北冬蟲夏草優良菌株的篩選

2.1.1 拮抗試驗 試驗結果表明，C1，C2，C3和C44個供試菌株生長良好，兩兩間拮抗線明顯，證明沒有重復，為4個不同品種。

2.1.2 出草試驗 從表2可以看出，4個品種的菌絲體在麥粒培養料上都可以生長，但吃透培養料的時間有所差異，封瓶時間最早的是C1。經新復極差試驗可知，C1的菌絲生長勢高于其他3種，C3沒有進行原基分化，C1的平均單瓶子實體產量最高，生物學效率為71.5%，明顯高于C2和C4，而且子實體粗、長，長勢均一。因此，供試的4個北冬蟲夏草菌株中，生物學特性以C1為最優，將其用于以后的生產和試驗。

表2 北冬蟲夏草4個菌株間生育特性比較

2.2 北冬蟲夏草母種培養基的篩選

不同培養基北冬蟲夏草中菌絲的生長速度列于表3。北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養基中的生長速度不同，菌絲平均生長速度由快到慢的順序依次是培養基B→A→C→E→D。多重比較表明，菌絲在培養基A中的生長速度和在培養基B，C，E中的生長速度差異不顯著，菌絲在培養基B中的生長速度略高于在培養基A，C，E中的生長速度，顯著高于在培養基D中的生長速度。北冬蟲夏草菌絲在培養基B中的生長速度最快，在培養基D中的生長速度最慢（表4）。

表3 北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養基中的生長速度 cm/d

表4 北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養基中生長速度的差異

北冬蟲夏草菌絲在選定的5種培養基中培養，生長狀況不盡相同。從菌絲密度、菌落邊緣整齊度、氣生菌絲量、菌絲生長勢方面觀察北冬蟲夏草菌絲的生長狀況，結果列于表5。在培養基A和B上，北冬蟲夏草菌絲稠密、粗壯、菌落邊緣整齊、氣生菌絲量適中，但由于北冬蟲夏草菌絲在培養基B中的生長速度最快，因此我們將B培養基選定為最優母種培養基，配方是：馬鈴薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂2%。

表5 不同培養基配方對北冬蟲夏草菌絲生長狀況的影響

3 結論與討論

3.1 結論

（1）在4個供試菌株中，拮抗試驗和出草試驗結果表明，由吉林桑蠶研究所引進的C1菌株在生長勢、子實體品質、子實體產量和生物學效率方面明顯優于其他3個菌株，適合在山西省進行栽培和推廣。

（2）在供試的5個母種培養基基礎上，篩選出的最適母種培養基配方為馬鈴薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂2%。

3.2 討論

由于我國推廣北冬蟲夏草栽培的時間較短，菌種多數從野生菌體中分離純化而得，很少進行孢子選育等穩定性育種工作。本試驗的菌株也存在這種情況，菌株間表現差異大，種性容易出現變異和退化，所以北冬蟲夏草育種工作亟待加強。另一方面，在現有基礎上，北冬蟲夏草商業化栽培時常出現同一品種菌株在不同季節、不同批次表現出很大差異，甚至同一批次還會出現部分培養基不產子座的現象。其中，菌種退化、壽命短、難保存是其最突出的問題，它們直接制約著北冬蟲夏草的栽培和生產。因為北冬蟲夏草對生長基質及生態環境與一般食用菌不同，而且長期采用無性繁殖及多次轉管的北冬蟲夏草菌種，其母種培養基因容易變異，表現為出草畸形甚至不出草，產量和質量都不穩定，生物轉化率較低[8]。

目前，對北冬蟲夏草的研究熱點仍主要集中在人工栽培技術和無性繁殖世代的研究上，探索北冬蟲夏草在人工培養基上失活的遺傳背景和分子遺傳變異基質及有效的保存方法，不僅具有理論價值，亦具有實際價值[9]。所以，菌株的季節性試驗、生長條件試驗和育種試驗具有同等重要的意義。任何一個優良菌種，只有在適宜的生長條件下，生理代謝活動才能正常進行，優良性狀才能得以表現。環境條件中最基本的是培養基質[10]。因此，對引進的菌種必須先進行母種培養基篩選試驗（以保證母種的質量），在母種培養基的篩選試驗中，菌絲生長發育好壞是鑒定環境是否合適的一個重要指標。

［1］ 劉波.中國藥用真菌[M].太原：山西人民出版社，1984.

［2］ 常明昌.食用菌栽培 [M].2版.北京：中國農業出版社，2009.

［3］王國棟.冬蟲夏草類——生態培植應用[M].北京：科學技術文獻出版社，1995．

［4］ 苑貴華.吉林蛹蟲草及馴化栽培[J].食用菌，1988（3）：8.

［5］ 李玉春.蛹蟲草人工培育技術的研究[J].中南林學院學報，1989，9（2）：212-217.

［6］ 陳國卿.遼寧蟲草研究[J].中國林副特產，1989（1）：4-6.

［7］ 田良才，牛天堂，李晉川.關于山西現代農業發展的戰略思考[J].山西農業科學，2009，37（9）：38-44.

［8］ 梁宗琦.蛹蟲草的無性型及子實體的人工培養研究 [J].西南農業學報，1990，3（2）：1-6.

［9］ 韓秀麗，方亮，周晶，等.虎榛子外生菌根合成與篩選的研究[J].華北農學報，2005，20（2）：101-104.

［10］ 渠繼紅，羅雯娟，韓曉芳，等.真姬菇原種及袋栽培養基配方的篩選[J].山西農業科學，2010，38（5）：18-20.