Defensin抗菌肽的序列特性分析

孫雁霞,鄔曉勇,何 鋼,宋 芹,王躍華

(成都大學藥用微生物資源重點實驗室,四川成都 610106)

Defensin抗菌肽的序列特性分析

孫雁霞,鄔曉勇,何 鋼,宋 芹,王躍華

(成都大學藥用微生物資源重點實驗室,四川成都 610106)

對defensin抗菌肽進行了生物信息學分析.一級結構表明其具有典型的昆蟲防御素特征.二級結構分析表明defensin抗菌肽中主要的結構元件為α-螺旋,但有例外.信號肽及導肽分析結果顯示defensin抗菌肽均屬于分泌型蛋白.通過對不同物種defensin抗菌肽的分析結果表明,非陽離子抗菌肽的作用機制可能是疏水作用力起主導作用或者是對細菌胞內酶結構與功能、對細菌胞內信號轉導的影響有關.

defensin類抗菌肽;序列特性;作用機制

0 引 言

defensin抗菌肽是昆蟲抗菌肽的代表,屬于昆蟲防御素類.其典型的特征是具有6個半胱氨酸殘基組成的3個分子內二硫鍵.它們的作用機制主要是通過在細胞膜上形成通道,引起細胞離子通透性的失衡和胞內物質的泄露,進而導致細胞活動的異常[1].由于其具有分子量小、熱穩定性強、水溶性好、無免疫原性、抗菌譜廣、強堿性等特點,是構成其自身免疫體系的重要組分,能非特異性地抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體,對腫瘤細胞、多重耐藥菌也有明顯的殺傷作用,且對正常生物體細胞無害,作用的機理非常獨特[1,2],不易引起微生物的耐藥性,是一類具有巨大發展潛力的新型抗菌藥物.

與傳統抗生素相比,昆蟲抗菌肽的抗菌活性還不夠理想[3,4],改造已有抗菌肽和設計新抗菌肽分子是創造高活力抗菌肽的有效途徑[5,6].這就需要進一步研究抗菌肽結構與活性的關系和作用機理,為抗菌肽分子的改造和設計提供足夠的理論依據.本文擬對家蠅defensin抗菌肽通過生物信息學手段進行分析,以為下一步抗菌肽分子的改造和設計提供基本的理論依據.

1 材料與方法

1.1 defensin抗菌肽序列的獲得

以家蠅 defensin序列 (GenBank登錄號：AY260152.1)為模板在NCBI中搜索相似序列獲得不同種類的defensin抗菌肽的序列,其如表1所示.

表1 不同種類defensin抗菌肽的一級結構分析

1.2 研究方法

defensin基因及其編碼的蛋白的一級結構用Proparam預測,導肽預測使用T arget P1.1 Server;信號肽預測使用SignalIP工具,二級結構采用 TMHMM2. 0SERVER分析,保守結構域分析采用NCBI鏈接的CDD分析,三維立體結構采用Cn-3D軟件分析等.

2 結果與分析

2.1 defensin抗菌肽的一級結構分析

由表1中數據可以看出,昆蟲的defensin抗菌肽都是由常見的20種氨基酸組成,都不含有O、U、B、Z、X這5種氨基酸,個別還不含有色氨酸(W),一般均含有7個左右的半胱氨酸(Cys)殘基,可形成3個及以上的分子內二硫鍵.電荷數分析表明,不同來源的defensin抗菌肽的電荷數也不相同,即出現了不帶電或帶負電荷的defensin抗菌肽.

2.2 defensin抗菌肽的二級結構分析

分析表明,蛋白質的二級結構為多肽鏈本身的折疊和盤繞(見表2).

表2 不同種類defensin抗菌肽的二級結構分析

由表2的結果可知,多數defensin抗菌肽中,α-螺旋是其主要構成元件,少數如煙草天蛾的主要構成元件則是無規則卷曲.

2.3 defensin抗菌肽的信號肽及導肽的分析

通常,分泌蛋白及細胞膜蛋白均以前體物質多肽的形式合成,其N末端含有作為通過膜時之信號的氨基酸序列,這種氨基酸序列被稱為信號肽或信號序列.對蛋白的信號肽及導肽進行預測可正確認識蛋白質的亞細胞定位和其作用.用Signal IP和target P分析表明(見表3),defensin抗菌肽均屬于信號肽序列,且信號肽的剪切位點均位于25左右,符合信號肽的概念.

表3 defensin抗菌肽的導肽及信號肽預測結果

2.4 defensin抗菌肽跨膜結構的預測

跨膜結構域是膜中蛋白與膜脂結合的主要部位,一般由20個左右的疏水氨基酸殘基組成,形成α-螺旋與膜脂相結合.預測和分析跨膜結構域,對認識蛋白質的結構、功能、分類以及在細胞中的作用部位均有一定的意義.用TMHMM 2.0 SERVER預測跨膜結構的結果表明,家蠅(見圖1)及其他物種的defensin抗菌肽均不跨膜.

圖1 家蠅defensin抗菌肽跨膜結構的預測

2.5 defensin抗菌肽的保守結構域分析

蛋白質由多個模體組成,組成這些模體的氨基酸區段行使特異的功能,同時還蘊含著各自的遺傳進化信息.利用NCBI鏈接的CDD分析家蠅及其他物種的defensin抗菌肽序列的保守結構域,得到了一致的結果(見圖2),屬于Defensin-2 superfamily家族.

圖2 家蠅defensin抗菌肽序列的保守結構域

2.6 defensin抗菌肽的三維結構

defensin抗菌肽的三維結構如圖3所示.

圖3 家蠅defensin抗菌肽的三維結構圖

從圖3中可看出,家蠅及其他物種的defensin抗菌肽中α-螺旋是其最主要的結構元件,并且在其N-端和C-端均有大量的α-螺旋(其余圖未顯示).

3 討論與結論

抗菌肽一直被認為帶有正電荷,并與帶負電荷的微生物細胞膜相互作用從而發揮抗菌功能.然而,從defensin抗菌肽的一級結構中發現,果蠅和埃及伊蚊不帶電,而廄鰲蠅、家蠶和煙草天蛾甚至帶的是負電荷.果蠅和埃及伊蚊雖然不帶電荷,但是顯疏水性.據此推測：既然沒有正負電荷間的相互作用力,所以疏水性作用力起主要作用,即疏水作用力使此抗菌肽與細菌細胞膜靠近接觸,從而發揮作用.

廄鰲蠅、家蠶的defensin抗菌肽雖然帶的是負電荷,然而疏水性相對數值比果蠅和埃及伊蚊大,尤其是負電荷帶的越多其疏水性數值越大,由此可以推測：此兩種昆蟲defensin的疏水性作用力大于負電荷間的相互排斥力,故同樣可以是蛋白和細菌細胞膜接觸結合.

煙草天蛾defensin,不僅帶負電荷,而且是親水性蛋白.信號肽分析結果表明,其N端有信號肽鏈,發揮作用時,信號肽引導其至作用位點,然后在其肽鏈第29～30(SVA-FE)氨基酸之間斷裂.分析其二級結構表明,其主要構成元件是無規則卷曲,這類有序的非重復性結構經常構成酶活性部位及蛋白質特異的功能部位,故推測其可能為酶類,作用于細胞膜表面的膜蛋白.經過protfun 2.2serve蛋白功能分析,結果顯示其是一個參與運輸及信號轉導的酶類蛋白,而此類抗菌肽的作用機制很可能與抗菌肽對細菌胞內酶結構與功能對細菌胞內信號轉導的影響有關.

[1]王義鵬,賴 仞.昆蟲抗菌肽結構、性質和基因調控[J].動物學研究,2010,31(1)：27-34.

[2]蔡 祿.生物信息學教程[M].北京：化學工業出版社, 2007.

[3]吳 希,張雙全.抗菌肽對細菌殺傷作用的分子機制[J].生物化學與生物物理進展,2005,32(12)：1109-1113.

[4]盧曉風,楊星勇.昆蟲抗菌肽及其研究進展[J].藥學學報,1999,34(2)：673-678.

[5]耿 華,安春菊,郝友進,等.昆蟲抗菌肽的結構和功能研究現狀[J].生物學通報,2004,39(10)：1-4.

[6]王學理,王興龍,劉 鍇,等.抗菌肽的作用機制與應用前景[J].動物醫學進展,2006,27(9)：42-45.

Sequence Characteristic Analysis of Defensin Antimicrobial Peptides

SUN Yanxia,WU Xiaoyong,HE Gang,SONG Qin,WANG Yuehua

(Key Laboratory of Medical Microbial Resources,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

Defensin antimicrobial peptides were analyzed by bioinformatics tools.Primary structure shows that the defensin has typical characteristics of insect defense.Secondary structure analysis shows that the main defensin antimicrobial peptides are alpha helix structure components,but there is an exception.The signal and target peptide analysis shows that defensin antimicrobial peptides belong to secrete protein.After the analysis of different species of defensin antimicrobial peptides,the results show that the mechanism of non-cation antimicrobial peptides is that hydrophobic force plays a leading role or antimicrobial peptides influence the structure and function of enzymes and signal transduction in bacteria cell.

defensin antimicrobial peptides;sequence characteristics;mechanism

Q74

：A

1004-5422(2010)02-0101-03

2009-12-25.

成都大學科技基金資助項目.

孫雁霞(1976—),女,博士研究生,講師,從事生物技術研究.