華南地區大豆根內拮抗菌AF-67篩選與鑒定*

區偉佳，王 榮，李敏清，袁英英，李華興

（華南農業大學資源環境學院，廣州 510642）

華南地區大豆根內拮抗菌AF-67篩選與鑒定*

區偉佳，王 榮，李敏清，袁英英，李華興**

（華南農業大學資源環境學院，廣州 510642）

篩選生防菌共436株，有生防性能71株，占16.3%，抑菌效果較好8株，占1.8%，能快速高命中率的獲得具有防病效果好、抑菌譜廣的生防菌株。內生菌AF-67與Fusarium oxysporum共培養時，能使其菌絲體及其分生孢子生長明顯畸變。經16S rDNA基因序列分析，AF-67被初步鑒定為Bacillus amyloliquefaciens。

大豆根腐病；根內拮抗菌；篩選；鑒定；16S rDNA

大豆根腐病(Soybean root rot)在國內外大豆產區均有發生，是土傳病害，危害較重[1]。該病對產量影響大，感病品種產量損失一般為5%～10%，嚴重的可達90%以上，甚至絕產。每年給國家造成巨額經濟損失[2,3]。華南大豆產區高溫多雨的氣候環境，土壤緊實粘重、偏酸等均有利于根腐病的發生[4]，關于解決華南產區大豆根腐病的研究越來越受科研工作者的關注。

生物防治手段普遍應用于植物病害防治。許多根際或根內微生物同時具有防病、促生作用。土壤施用含有該生防菌株的生物肥料能減少農藥的用量，降低成本，同時還能改善土壤條件及農產品品質[5]。在生防菌株的篩選源上，考慮生防菌在植株根部的定殖效果，著重研究從植株根際或根內中篩選。有研究表明，從根際或根內分離篩選出的拮抗菌能更好的定殖在植株根系[6,7]。

芽孢桿菌作為目標菌群，更能適合于生物肥料工業生產的要求。研究通過對有效生防菌的16S rDNA序列分析，確定生防菌的種類和來源。旨在提供一種快速、準確的生防菌選鑒方法。

1 材料與方法

1.1 細菌分離材料

采自華南農業大學博羅、寧西大豆試驗田的大豆植株。

1.2 供試大豆根腐病原菌

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 3個高致病性菌株 F1、F2、F5；

絲核菌（Rhizoctoniasp）；

小核菌(Sclerotium rolfssii)；

以上供試菌種由華南農業大學資源環境學院根系中心分離與提供。

1.3 根內拮抗芽孢桿菌AF-67的分離

選取健康強壯大豆植株根系，表面消毒后，無菌狀態置于滅菌研缽，加入適量LB培養基和滅菌石英砂，充分研磨后轉入含50mL LB液體培養基中，150rpm富集培養30min。取出，置于80℃恒溫水浴10min。培養液稀釋后，取適當濃度涂布LB平板，36℃培養48h后挑取形態不同、長勢較好的菌落，劃線純化。

1.4 拮抗菌篩選、抑菌效果與菌間相容性測定 [8,9]

距PDA平板中心3cm處互相垂直四個方向點接拮抗細菌，平板的中央接種經過活化的尖孢鐮刀菌菌塊(直徑5mm)，28℃黑暗培養12d后記錄菌圈直徑，設5個重復。公式如下：

同時按上述的方法對絲核菌、小核菌進行拮抗性測定。

菌間相容性采用交叉劃線法：取待檢拮抗菌液依次兩兩交叉劃線，在劃線的交叉處出現透明不生長，為菌間不相容；無出現透明點，能正常生長為菌間相容[8，9]。

1.5 拮抗菌AF-67的鑒定

形態鑒定參照《伯杰氏鑒定細菌學手冊》[10]；AF-67鑒定方法采用分子生物學16S rDNA序列分析：取培養至對數期菌液，用細菌DNA提取試劑盒提取AF-67的總DNA。配制擴增體系50uL，其中，正向引物K01(FC27):5’AGAGTTTGATCCTGGCTCA G 3’；反向引物K02(RC1492):5’TACGGCTACCTT GTTACGACTT 3’。PCR產物由北京奧科生物技術有限責任公司測序。序列結果通過BLASTN程序在GenBank核酸數據庫中進行分析，確定其分類地位。

1.6 AF-67培養液對尖孢鐮刀菌菌絲發育影響

將尖孢鐮刀菌（F5） 菌塊(直徑5mm)與AF-67菌懸液3mL加入50mLKB培養液中，28℃，150rpm培養3d。吸取少量培養液，顯微鏡下觀察真菌菌絲的生長情況。對照接病原菌塊的KB培養液。

2 結果和討論

2.1 大豆根內拮抗菌分離與篩選

從大豆根內篩選出候選生防菌共436株，其中具有生防性能71株，占16.3%，其中對大豆根腐病原菌具明顯抑制作用8株，占1.8%，抑菌效果見表1。

試驗證明該法能高命中率的獲得具有防病效果好、抑菌譜廣的生防菌株。由表1可知，所得菌株對峙試驗后15d仍保持高抑菌效果性能。

表1 生防菌對大豆根腐病菌抑菌效果 %

2.2 生防菌相容性測定

生防菌間相容性測試結果顯示（見表2），菌株AF8與其他大部分生防菌顯示不相容性，其他菌株均顯示可以共存。

表2 生防菌間相容性測試結果

2.3 拮抗菌AF-67的16S rDNA分子生物學鑒定

圖1 拮抗菌AF-67的16S rDNA電泳條帶及其測序峰圖片段

優選有代表性，編號為AF-67拮抗細菌，16S rDNA序列比對結果經GenBank(NCBI)比對，登記號為lcl58891。根據同源性比較（見表3），與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp） 同源性最高，達99%，與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilus） 同源性也達97%。

表3 AF-67 16S rDNA在GenBank(NCBI)比對結果

拮抗菌16S rDNA的PCR擴增條帶單一、清晰，位于約1.5kb處。其序列峰圖效果理想，無出現錯峰套峰，測序結果可靠性高（見圖1）。

測序結果在GenBank核酸數據庫中分析，構建系統發育樹（見圖2），分析遺傳距離，其種間親緣關系表明AF-67與B.Amyloliquefaciens的親緣關系最近，且在同一個分支中，這再次驗證了AF-67最可能為解淀粉芽孢桿菌。

2.4 AF-67對尖孢鐮刀菌菌絲發育影響

拮抗菌AF-67與鐮刀菌共培養后發現，能明顯抑制病菌菌絲的生長（見圖3）。菌絲體局部明顯膨大、腫脹，菌絲不發育，同時有畸形、斷裂現象，菌絲體分隔數顯著增多。細胞內含物大量凝聚，部分形成大且透明的空泡。與對照相比，經共培養的鐮刀菌產孢量明顯減少。

圖2 AF-67的系統發育樹

圖3 AF-67對尖孢鐮刀菌菌絲發育影響

3 討論

鑒于芽孢桿菌屬的生物安全性、耐熱特性和生產上的可操作性，試驗能快速直接篩選出目標生防菌。結合分子生物學技術，對于難于培養、生化反應不明顯及遺傳表型等手段不能鑒定的細菌，采用此法提供快捷可行的解決方案。

造成大豆根腐的致病菌種類繁多雜亂，地域差異性大[11]。篩選的8株生防菌對幾種華南地區的常見致病菌均顯示較好抑菌效果。靶標菌中，國內以Fusarium oxysporum的出現頻率最多[12，13]，大豆項目科研基地的感病植株，其5號高致病性菌株的分離率最高。篩選的AF-67對Fusarium oxysporum菌絲生長有一定的抑制作用，具開發利用潛力。

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In this study,the improved traditional screening methods could quickly obtain strains which showed antagonistic activity against soybean root rot and broad antagonistic spectrum.The activity of 436 strains assayed，16.3%of them showed antagonistic activity againstF.oxysporumf.sp.soybean and one of them,strain AF67 isolated from soybean roots was the best.Co-culture with Fusarium oxysporum,mycelium and conidia were evident distortion.Based on the sequence of 16S rDNA,strain AF67 was identified asBacillusamyloliquefaciens.

Soybean root rot;Antifungal Entophytic Bacteria;Isolation;Characterization;16S rDNA

S432.4+4

B

1674-3547(2010)02-0018-04

2009-12-22；修回日期：2010-01-12

國家自然科學基金項目（40971155）；廣東省“十一五”攻關項目（2006B20301050），廣東省教育部產學研結合項目（2009B090300330），廣東省農業廳科技項目（粵農土肥（2004）28號）。

李華興，男，教授，華南農業大學資源環境學院，E-mail:huaxli@scau.edu.cn