實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌檢測方法的改良

周莎桑，戴方偉，宋曉明，柯賢福，周文偉，薩曉嬰

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310013)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌檢測方法的改良

周莎桑，戴方偉，宋曉明，柯賢福，周文偉，薩曉嬰

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310013)

目的 對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌2種培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較。方法 將采集到的3只皮膚真菌感染病兔樣品經(jīng)由沙氏平皿法和沙氏試管斜面培養(yǎng)法分別進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果 在3只真菌感染病兔中應(yīng)用試管斜面法我們只檢測到1例皮膚病原真菌陽性，而采用沙氏平皿法3例陽性全部檢出。結(jié)論 結(jié)合臨床檢測經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)為本研究的沙氏平皿法優(yōu)于沙氏試管斜面法，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌常規(guī)檢測中具有推廣應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;皮膚病原真菌;檢測方法;改良

皮膚病原真菌是小鼠、大鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見致病菌，在各類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中必須排除。作者在長期實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，真菌的檢出率與真菌的培養(yǎng)方法有很大的關(guān)系。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14926.4－2001中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌檢測要求采用沙氏試管斜面三點(diǎn)培養(yǎng)法［1］，在常規(guī)檢測中我們發(fā)現(xiàn)，由于試管斜面面積小，當(dāng)多種菌混合生長時(shí)，在對斜面培養(yǎng)物進(jìn)行DTM平皿轉(zhuǎn)接時(shí)很難采集到可疑菌，從而造成漏檢。因此，我們對此進(jìn)行了改良，采用沙氏平皿培養(yǎng)法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭兔由某單位兔房提供［SCXK(浙)2009-0039］。選取3只疑似自然感染皮膚病原真菌病兔，臨床癥狀可見耳根部及耳周圍有多處白色結(jié)痂，大小不等，突出于皮膚表面，與周圍界限比較清晰，取樣時(shí)結(jié)痂不易剝落，強(qiáng)行剝離時(shí)會(huì)有血液滲出。結(jié)痂周圍皮毛較少，粗糙無光。

1.2 培養(yǎng)基

葡萄糖蛋白胨瓊脂(沙氏培養(yǎng)基)、皮膚癬菌鑒別瓊脂(DTM)、乳酸酚棉藍(lán)染色液，按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，微生物學(xué)檢測方法［1］GB/T14926.43-2001 4.16和4.17方法進(jìn)行配制。

1.3 病原培養(yǎng)方法

將采集到的3只真菌感染病兔樣品分兩種培養(yǎng)方法分別進(jìn)行培養(yǎng):一種為國標(biāo)皮膚病原真菌檢測方法中所采用的試管斜面培養(yǎng)法;另一種是我們進(jìn)行改良的沙氏平皿法，即將沙氏培養(yǎng)基倒于平皿，每皿約20mL，待冷卻后備用。無菌采集皮膚真菌感染病兔病灶附近結(jié)痂塊及毛發(fā)接種于試管斜面和平皿培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)入DTM鑒別瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d。

1.4 結(jié)果鑒定

根據(jù)沙氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，DTM鑒別瓊脂及乳酸酚棉藍(lán)染色結(jié)果進(jìn)行菌株鑒定。

2 結(jié)果(圖1～3見彩插7)

2.1 沙氏培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)方法比較

沙氏培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)果見表1。由表1可見，1號(hào)兔、2號(hào)兔平皿培養(yǎng)法，3號(hào)兔試管斜面培養(yǎng)法菌落形態(tài)相對較單一，僅隨培養(yǎng)時(shí)間的增長菌落大小發(fā)生改變。2號(hào)兔試管斜面菌落形態(tài)未見明顯變化，第7～14天菌落由白色變?yōu)樽攸S色(詳見表1)。1號(hào)兔試管斜面培養(yǎng)菌落生長迅速，第3天已充滿斜面并向上生長，形態(tài)為白色及灰色絨毛狀。第7天試管上端出現(xiàn)黃色顆粒狀菌落，培養(yǎng)至14 d黃色顆粒狀菌落變?yōu)榭Х壬?圖1A)。3號(hào)兔平皿培養(yǎng)第3天菌落形態(tài)較小，為白色粉末狀及咖啡色顆粒狀并有皺折，菌落背面為棕黃色。第7天菌落形態(tài)逐漸增大，第14天菌落已基本鋪滿整皿，咖啡色顆粒狀居多(圖1B)。

2.2 DTM(鑒別瓊脂)培養(yǎng)結(jié)果

沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)第14天后，轉(zhuǎn)接DTM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果3個(gè)樣本平皿法培養(yǎng)的菌落均能使DTM由黃變紅，菌落形態(tài)及色澤與病原真菌沙氏培養(yǎng)判定標(biāo)準(zhǔn)較一致，而試管斜面法培養(yǎng)的菌落僅3號(hào)樣能使DTM由黃變紅，其余均未變色(圖2)。

2.3 真菌菌株鑒定

結(jié)果顯示沙氏平皿法在3個(gè)樣本中均培養(yǎng)出皮膚病原真菌，經(jīng)鑒定為石膏樣毛癬菌，試管斜面法僅3號(hào)兔檢出皮膚病原真菌，鑒定結(jié)果為石膏樣毛癬菌，乳酸酚棉藍(lán)染色鏡檢見許多小分生孢子圓形，單個(gè)或成叢，有螺旋菌絲(圖3A)，大量棒狀大分生孢子2～6個(gè)隔(圖3B)。

3 討論

石膏樣毛癬菌是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要致病性真菌之一，主要引起人獸共患的皮膚病［2］。真菌多以孢子的形式傳播和存在，一般情況下難以清除干凈［3］。病兔是其主要傳染源，且可在兔－人之間傳播［4］，尤其是飼養(yǎng)員，浙江省某兔房就發(fā)生過一例飼養(yǎng)人員被感染的病例［3］。因此為了保障科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和避免人員受染，應(yīng)定期對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測并做好環(huán)境消毒等工作。

本研究比較了沙氏試管斜面法和沙氏平皿法后發(fā)現(xiàn)，平皿法較試管斜面法操作方便，且較易分離可疑菌。1號(hào)樣在試管斜面培養(yǎng)3 d后菌落已布滿斜面并沿管壁向上生長，且菌落不單一，灰色及白色絨毛狀?yuàn)A雜生長，而臨床需要分離的僅為白色絨毛狀可疑菌。由于不同菌落混雜，灰色雜菌呈優(yōu)勢生長，加之試管斜面面積較小，不易挑取單一菌落，故轉(zhuǎn)種DTM后目標(biāo)菌因被雜菌掩蓋而未能與沙氏培養(yǎng)結(jié)果保持一致(圖2)。我們在臨床檢測中也常遇到同樣的難題，因多種菌落混合生長導(dǎo)致轉(zhuǎn)種DTM時(shí)極易夾雜其他霉菌。一旦雜菌在DTM呈優(yōu)勢生長，往往無法檢出病原真菌。3號(hào)樣在沙氏平皿法中菌落并不單一(圖1)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其他霉菌類也在平皿上形成了優(yōu)勢生長，但平皿培養(yǎng)表面較大可使標(biāo)本散布，便于觀察菌落形態(tài)及較方便地采集可疑菌［5］。經(jīng)轉(zhuǎn)接DTM平皿后，平皿法所培養(yǎng)的3個(gè)樣品菌落形態(tài)及色澤與沙氏培養(yǎng)結(jié)果完全吻合，未發(fā)生變異。在本研究的試管斜面培養(yǎng)法中，僅3號(hào)樣品的沙氏培養(yǎng)為單一菌落，故轉(zhuǎn)種后菌落形態(tài)及色澤與沙氏培養(yǎng)結(jié)果一致，未發(fā)生變異。綜上所述，我們認(rèn)為，平皿法可彌補(bǔ)因試管法斜面面積過小、空間過窄而影響病原真菌分離鑒定中敏感性不足的缺陷。另外，由于試管斜面面積小，培養(yǎng)基厚薄不均，導(dǎo)致真菌較易發(fā)生變異，可能出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌落性狀、色素以及各種生理性狀(包括毒力)的改變，影響病原真菌分離與鑒定的準(zhǔn)確性，因此在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌接種分離培養(yǎng)時(shí)，我們建議沙氏平皿法代替試管斜面法。

表1 沙氏試管斜面法與沙氏平皿法對家兔皮膚病原真菌檢測的比較Tab.1 Diagnostic comparison of pathogenic dermatophytes by Sabouraud's platiculture and slant cultivation

參考文獻(xiàn):

［1］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)［S］.GB/T14926.4-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測方法(2).

［2］Kunstyr I， Jelmek F， Bitzenhofer U， et al.Fungus paccilomyces:a new agent in laboratory animals［J］.Lab Anim Sci，1997，31(1):45－51.

［3］韋強(qiáng)，佟承剛.家兔石膏樣毛癬菌病的診治［J］.中國養(yǎng)兔雜志，1993，4:6－7.

［4］李金永，劉振華，孫華，等.家兔體表真菌病的防治［J］.獸藥市場指南，2005，6:40－40.

［5］倪語星，尚紅.臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)(第4版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.

Modification of the Detection Method for Pathogenic Dermatophytes in Laboratory Animals

ZHOU Sha-sang，DAI Fang-wei，SONG Xiao-ming，KE Xian-fu，ZHOU Wen-wei，SA Xiao-ying
(Zhejiang Academy of Medical Sciences，Zhejiang Provincial Laboratory of Experimental Animal and Safety Evaluation Research，Hangzhou 310013，China)

Objective To compare the modified method with one conventional method for diagnosis of pathogenic dermatophytes in laboratory animals.Methods Three samples were obtained from rabbits with pathogenic dermatophytes and inoculated on Sabouraud's platiculture and slant cultivation.After incubation for at least 14 days，pathogenic dermatophytes were detected according to the national standards.Results By Sabouraud's platiculture we confirmed three pathogenic dermatophytes whereas only one out of three were detected by Sabouraud's slant cultivation.Conclusion It can be concluded that the modified method(Sabouraud's platiculture)is more suitable than the slant cultivation for diagnosis of pathogenic dermatophytes in laboratory animals and therefore might be recommended for future use in clinical diagnosis.

Laboratory animals;Pathogenic dermatophytes;Detection methods;Modification

R-333

B

1671-7856(2010)06-0058-03

2010-03-03

圖1 兩種沙氏培養(yǎng)方法的比較
Fig.1 Comparison of Sabouraud's platiculture and slant cultivation for detection of pathogenic dermatophytes

注：A為沙氏試管斜面培養(yǎng)14 d，B為沙氏平皿培養(yǎng)14 d。
Note: Samples Were cultured for 14 days on Sabouraud's slant culture (A)and Sabouraud's plate (B)

圖2 DTM培養(yǎng)結(jié)果
Fig.2 Detection of pathogenic dermatophytes by DTM agar

注：各圖中，左側(cè)皿均為沙氏試管斜面轉(zhuǎn)DTM平皿，右側(cè)皿為沙氏平皿轉(zhuǎn)DTM平皿。
Note: In No. 1， 2 and 3， samples previously cultured by Sabouraud's slant cultivation Were inoculated on the left DTM plate;those previously incubated on Sabouraud's plate Were inoculated on the right.

圖3 石膏樣毛癬菌鏡檢結(jié)果（乳酸棉酚藍(lán)染色，400×）
Fig.3 Diagnosis of gypsum-like Trichophyton rubrum by optical microscopy (Lactophenol cotton blue stain， 400×)

注：A: 螺旋菌絲B: 棒狀大抱子
Note：A: Spiral hyphae; B: Stick-shaped megaspore

周莎桑(1983－)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制與疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究。E-mail:zhoushasang@163.com

周文偉。