大鼠心肌梗死動物模型的制備

王 燕，陳光輝，尹作民，劉為生

(1.山東省青島市中心醫院＆青島大學第二附屬醫院，青島 266042;2.中國人民解放軍總醫院心內科實驗室，北京 100853)

大鼠心肌梗死動物模型的制備

王 燕1，陳光輝2，尹作民1，劉為生1

(1.山東省青島市中心醫院＆青島大學第二附屬醫院，青島 266042;2.中國人民解放軍總醫院心內科實驗室，北京 100853)

目的 建立一種穩定可重復的大鼠急性心肌梗死動物模型。方法 SD大鼠經口氣管插管，呼吸機輔助呼吸，開胸結扎冠脈左前降支。術后28 d行心臟超聲，血流動力學及組織病理學檢查。結果 大鼠術后存活率60%;手術組LVEF較假手術組顯著降低(P＜0.01);與假手術組比，手術組的LVSP明顯下降(P＜0.05)，±dp/dt顯著降低(P＜0.01)，而LVEDP明顯升高(P＜0.01);病理組織學檢查可見瘢痕形成，纖維組織增生。結論 本文建立心肌梗死動物模型的方法操作簡便、重復性好。

心肌梗死;冠狀動脈;模型，動物;大鼠

在心肌梗死發病率和死亡率不斷上升，嚴重威脅人類健康的今天，成功制備心肌梗死動物模型是我們進行相關研究，攻克這一難題的基礎。而且心肌梗死動物模型的質量及成功率將直接影響到研究的可信度和速度，因此，本研究在綜合以往大鼠心肌梗死模型制作方法的基礎上，通過不斷總結經驗和改進方法，建立了一種穩定、可靠、操作簡便、成活率高的心肌梗死動物模型制作方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

兩月齡雄性 SD大鼠20只，體重250±30 g，由中國人民解放軍總醫院試驗動物中心提供［京動防(合)字第(04089)號］。隨機分為兩組:手術組10只，結扎冠狀動脈左前降支;假手術組10只，在相應位置穿線，不結扎。

1.2 研究方法

1.2.1 MI模型的建立:3%水合氯醛按10mL/Kg腹腔注射麻醉動物，將動物固定于手術臺。心電監護，氣管插管，呼吸機正壓輔助呼吸，潮氣量10mL/min，吸呼比1∶2，呼吸頻率65次/min。用組織剪手術區域剪毛，2%碘伏消毒局部皮膚三遍，75%酒精脫碘，戴無菌手套。于大鼠左側第四肋間橫切口開胸，組織剪剪斷上緣肋骨，充分暴露心臟，自制小拉鉤固定。小心剪開心包，參照 Olivette的方法［1］，在肺動脈圓錐與左心耳之間下方1～2mm處用6－0無損傷線結扎冠脈左前降支及一小束心肌，心電圖示V1～V5胸前導聯ST段弓背或水平抬高，左心室前壁顏色變白為成功的標志。逐層縫合胸壁肌肉及皮膚。腹腔注射青霉素，呼吸機輔助呼吸至自主呼吸恢復，送回籠中喂養。

1.2.2 心臟超聲檢查:固定超聲工作人員，單盲控制。心臟探頭14V3，頻率6 Hz。經左側胸壁，左室長軸、短軸切面觀察室壁運動情況。在長軸切面左心室乳頭肌水平，M型超聲測量三個心動周期的左心室舒張末內徑(LVIDd)及左心室收縮末內徑(LVIDs)，并各取其均值。以機器內置的Teich公式計算左室射血分數(LVEF)。動物于術前及術后28 d進行心臟超聲檢查，記錄數據。

1.2.3 血流動力學左心功能測定:冠脈結扎術后4周，3%水合氯醛腹腔注射再次麻醉大鼠，固定于手術臺。復查12導聯心電圖。直徑約2mm的動脈導管聯接壓力感受器及多導生理記錄儀，肝素鹽水排凈氣泡，檢查動脈導管是否暢通及壓力感受器是否敏感。將壓力感受器探頭置于與大鼠左心房同一水平，進行調零。用組織剪手術區域剪毛，2%碘伏消毒局部皮膚三遍，75%酒精脫碘，戴無菌手套。頸部正中切口，分離右側頸總動脈，結扎遠心端，動脈導管夾閉近心端。眼科剪在頸總動脈壁上剪開一小口，沿頸總動脈插入導管，放開動脈夾，將導管插至左心室，連續記錄左心室收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)和左心室內壓上升下降最大速率(±dp/dt)。并同步記錄心率。

1.2.4 心臟標本的處理及HE染色:完成上述血流動力學檢測后，經左心室導管放血處死動物。立即開胸，取出心臟，PBS沖洗血液，10%中性福爾馬林固定。1個月內進行石蠟包埋，切片。各取一張5 μm的切片做HE染色。

1.2.5 統計學方法:數據以均值±標準差表示，兩組間均數的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠生存情況

手術組于術中出現心律失常及急性左心衰死亡1只，術后死于慢性充血性心力衰竭1只，死于麻醉1只，進行心臟超聲檢查時死亡1只，存活率60%;假手術組術中死于急性心律失常1只，術后無死亡，存活率90%。兩組存活率有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 心電圖改變情況

圖1 冠脈結扎后大鼠心電圖改變Fig.1 ECG change after coronary atery ligated

手術組結扎冠脈左前降支后，立即出現胸前導聯V1～V6ST段水平或弓背上抬，下壁導聯Ⅱ、Ⅲ、aVF ST段水平壓低(圖1)。

2.3 心臟超聲檢查改變情況

術后28 d心臟超聲檢查可見左心室前壁運動減弱，與后壁心肌呈同向運動(圖2，見彩插6);左室射血分數明顯降低(表1)。

表1 冠脈結扎前后超聲檢查心功能改變Tab.1 Change of heart function through echocardiogram after coronary atery ligated

2.4 血流動力學改變情況

術后28 d，與假手術組比，手術組的LVSP明顯下降(P＜0.05)，±dp/dt顯著降低(P＜0.01)，而LVEDP明顯升高(P＜0.01)(表2)。

表2 冠脈結扎前后血流動力學改變情況Tab.2 Change of haemodynamics after coronary atery ligated

2.5 心肌組織HE染色

假手術大鼠心肌細胞橫紋及閏盤清晰，纖維結構清楚、排列整齊;冠脈結扎術后4周，心臟大體標本可見瘢痕形成，心臟前壁塌陷，室壁變薄。病理切片顯示心肌纖維排列紊亂，核溶解，甚至心肌細胞消失，形成膠原纖維組織(圖3，見彩插6)。

3 討論

隨著心肌梗死發病率的升高，用于心肌梗死基礎研究的動物模型的需求量也不斷增加。建立可靠的心肌梗死動物模型是保證試驗順利進行的第一步，心肌梗死動物模型的制作也成為心血管內科研究人員一項基本的操作技術［2］。

目前常用于復制心肌梗死模型所選用的動物，大多用哺乳動物，如犬、兔、小牛、豬、豚鼠、大鼠等。靈長類動物狒狒、猴子當然有其他動物不可比擬的優越性，但其材料難得，不易普通使用。犬的體積大小適中，性情溫順易于訓練。但犬的冠狀血管結構和人相比，有較大差異，尤其是犬冠狀動脈變異多，側支吻合豐富，室間隔動脈特別發達等，常使心肌梗死的面積不易控制。豬冠狀循環系統結構酷似人類，但易發生急性心律失常，模型成活率較低。另外，犬、豬都存在成本較高，飼養不便的缺點。故近年來轉而多用兔、鼠等小動物。用大鼠制造心肌梗死的方法，經簡化、改進而趨于成熟，現在國內外已普遍使用。

在大鼠心梗模型制作方法上，有多種方案可供選擇，各有利弊，也因人而異。目前國內外常用的方法有:(1)藥物法:多采用兒茶酚胺或垂體后葉素等收縮冠狀動脈的藥物，進行皮下或腹腔注射［3］。這種方法操作簡便，成活率高，但心肌梗死的面積不能控制。(2)冰凍法:采用在液氮中低溫冷凍的金屬片在大鼠左心室游離壁反復冷凍直至壞死［4］。這種方法易于掌握，心梗面積也相對恒定，但不易形成透壁心梗，與心肌梗死的自然過程存在差異。(3)冠脈阻斷法:結扎冠狀動脈是制作心肌梗死動物模型最常用的方法。國外有采用Jons法［5］，乙醚麻醉，在自主呼吸條件下，不用呼吸機輔助呼吸，迅速開胸擠出心臟進行冠狀動脈結扎。這種方法所需時間短，動物麻醉淺，易于蘇醒，但技術難度高，須經反復練習才能掌握。隨著技術的不斷改進，我們參照Olivette的方法，應用呼吸機輔助呼吸，撐開胸壁進行冠脈結扎，不僅易于掌握，也提高了模型的質量和成活率。

應用呼吸機氣道建立上，也有面罩呼吸、氣管插管、氣管切開等多種方法可供選擇。面罩呼吸最為簡單，但通氣量往往不足，氣體也容易誤吸入消化道，效果不理想。氣管切開操作也相對簡單，且通氣確切，但術中術后氣道分泌物較多，不易護理，容易造成氣道感染，在某種程度上提高了術后并發癥的發病率和動物的死亡率。因此，我們采用了氣管插管的方法進行通氣。雖然這種方法需要一些技巧，但對動物氣道損傷小，術后恢復較好。主要要點如下:(1)保證動物麻醉較深。麻醉較淺的動物在導管插入時，嘔吐反射較強，難以成功。以鉗夾大鼠四肢末端，其反應較弱或無掙扎反應為宜。(2)提起大鼠舌頭，盡量沿舌根插入導管，并且會有輕微突破感，繼續插入會感到氣管環的頓錯感。否則極可能誤插入食道。(3)速度要快。在大鼠發生嘔吐反射前插入，否則導管因大鼠嘔吐易進入食管。(4)在不確定導管位置時，可對大鼠進行試通氣，若大鼠自主呼吸消失，呼吸加深，頻率與呼吸機通氣頻率一致，且為胸式呼吸時，可確定氣管插管成功;若試通氣時，大鼠仍有自主呼吸，且呼吸頻率加快，伴有腹部漸膨隆，則氣管插管位于食道內，應立即拔管重插。

另外，在麻醉方法上，有戊巴比妥，硫噴妥鈉，氯胺酮，乙醚，水合氯醛等可以選擇。戊巴比妥麻醉效果好，麻醉時間長，利于手術操作，但存在術后蘇醒遲的缺點。硫噴妥鈉、氯胺酮、乙醚作用時間短，利于術后恢復，但麻醉效果差，同時乙醚用時要注意個人防護及煙火。本實驗體會水合氯醛腹腔注射麻醉效果好，時間適宜，操作簡便，利于動物的術后恢復。

手術結扎的具體部位需經過反復摸索，以期達到統一心梗面積的模型。我們的體會是:盡量固定在左心耳下緣與肺動脈圓錐之間進行結扎，并結合心電圖胸前導聯V1～V6ST段的上抬，能達到理想的效果。若結扎位置偏高，則動物易發生急性心律失常而死亡率大大上升;若結扎位置偏低，則心梗面積較小，在心功能的指標上則表現不明確。

在心衰程度的評價上，近年來，隨著對心衰研究的深入，心鈉素(ANP)和腦鈉素(BNP)［6，7］在心衰程度的評價上越來越受到重視。本實驗所采用的心臟超聲檢查及血流動力學檢查略顯粗糙。

總之，通過我們對麻醉方法、氣道建立及結扎位置的摸索和改進，基本建立了一種能較理想模擬臨床冠心病－心梗－心衰病程的動物模型。并且操作簡便，經濟實用，模型可穩定復制，可以在心肌梗死的進一步研究中發揮作用。

［1］Olivetti G，Capasso JM，Meggs LG，et al.Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］.Circ Res，1991，68:856－869.

［2］劉尊齊，崔連群，蓋玉生.大鼠急性心肌梗死模型的制備［J］.基礎醫學與臨床，2007，7(9)34－35.

［3］郭津，徐長慶，李鴻珠.異丙腎性心肌梗死大鼠鈣敏感受體的表達和凋亡通路的變化［J］.中國病理生理雜志，2009，25(1):117－119.

［4］Tomita S，Li RK，Weisel RD，et al.Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function［J］.Circulation，1999，100:247－256.

［5］Johns TNP，Olson BJ.Experimental myocardial infarction:A method of coronary occlusion in small animals［J］.Ann Surg，1954，10(5):509－516.

［6］Kasama S， FuruyaM， ToyamaT， et al.Effectofatrial natriuretic peptide on left ventricular remodelling in patients with acute myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2008，29(12):1485－1494.

［7］Braunwald E.Acute coronary syndromes:BNP measurement predicts AMI risk in the elderly［J］.Nat Rev Cardiol，2009，6(8):503－504.

Establishment of a Rat Experimental Model of Acute Myocardial Infarction

WANG Yan1，CHEN Guang－hui2，YIN Zuo－min1，LIU Wei－sheng1
(1.Qingdao Central Hospital＆ Second Facilitated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266042，China;2.Laboratory of Cardiology，China PLA General Hospital，Beijing 100853，China)

Objective To develop a steady and reproducible myocardial infarction(MI)model in rats.Methods SD rats were endotracheal incubated through mouth and ventilator－assisted breathing，the left anterior descending coronary artery was ligated.Echocardiogram，haemodynamics and histopathology were detected twenty－eight days after ligation.Results Survival rate of the rat model was 60%.LVEF of the AMI group decreased significantly(P＜0.01).Compared with the sham group，LVSP and ±dp/dt of the AMI group decreased significantly(P＜0.05，P＜0.01)，but the LVEDP of the AMI rat increased significantly(P＜0.01).Histopathology study could seen the scar and the proliferation of the fibrous tissue.Conclusions This experiment provids an easy way to establish the MI model，which is reproducible and credible.

Myocardial infarction;Coronary artery;Model，animal;Rat

R332

B

1671－7856(2010)06－0054－04

2009－12－23

圖2 冠脈結扎前后大鼠心臟M型超聲改變情況
Fig.2 Echocardiogram change after coronary atery ligated

圖3 冠脈結扎后大鼠心臟病理變化
Fig.3 Histopathology after coronary atery ligated

注：A: 急性心肌梗死后4周心臟大體標本，B: 梗死心臟橫切面，C: 梗死心肌病理切片，D: 正常心肌病理切片。
Note: A: the heart of acute myocardial infarction for 4 Weeks; B: the across-section of the infarcted heart; C: the pathology of infarcted heart（×200）; D: the pathology of normal heart（×200）.

國家自然科學基金資助項目(30471924)。

王燕。E－mail:wangyan94142@sina.com.cn