磁珠富集法篩選實驗豚鼠微衛星分子標記

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

磁珠富集法篩選實驗豚鼠微衛星分子標記

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

目的 直接從實驗豚鼠基因組DNA中篩選獲得微衛星分子標記。方法 應用磁珠和生物素標記的微衛星探針與豚鼠基因組酶切片段雜交，捕獲200～1000 bp含有微衛星序列的DNA片段，連接到pMD－18V載體中，轉化到感受態細胞E.coli DH5α中構建富集微衛星序列的小片段插入文庫。然后用PCR法進行篩選。結果 從約2000個轉化子中獲得240個陽性克隆。對其中98個進行了測序，并成功設計豚鼠微衛星引物17對。結論 經過優化的磁珠富集法能夠穩定、高效地獲得豚鼠微衛星標記。本研究獲得的微衛星位點將成為豚鼠遺傳學研究的有力工具。

豚鼠;磁珠富集法;微衛星

豚鼠是一種具有特殊的生物學特性和生理解剖特點的動物。該物種易被致敏，體內血清補體含量在實驗動物中最高，皮膚對毒物刺激反應靈敏且接近人類，體內不能合成維生素C，耳殼大且聽力敏銳，因而一直被大量應用于過敏性哮喘研究、免疫學研究中補體的獲得、局部皮膚刺激試驗、試驗性壞血病的研究以及耳科學的研究［1］。另外，豚鼠個體小，性情溫順，容易飼養和抓取，這些特點都使其成為一種被廣泛使用的實驗動物。

微衛星DNA(microsatellite DNA)是指以幾個核苷酸(一般為1～6個)多次重復組成的串聯序列。由于高度可變區核心序列重復數目的不同，產生了DNA的多態性［2］，又被稱為簡單序列重復(simple sequence repeats，SSR)，其長度大多在100 bp以內。

小鼠、大鼠、沙鼠、家兔、犬、豬和獼猴等實驗動物的微衛星標記都有專門的報導并且被應用于實驗動物遺傳圖譜構建、數量性狀位點定位、標記輔助選擇、遺傳多樣性評估和遺傳監測等領域，推動了人類疾病動物模型建立、功能基因定位和克隆、實驗動物品系保持和新品系培育等研究工作的進步［3－8］。豚鼠在遺傳背景上與大小鼠、家兔等物種差別比較大［9，10］，無法借鑒這些物種的微衛星位點進行擴增。

本研究從豚鼠基因組中分離篩選出17個微衛星位點，建立豚鼠微衛星文庫，為深入研究豚鼠遺傳學特征和功能提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器

本研究使用的Dunkin Hartley種實驗豚鼠由浙江中醫藥大學實驗豚鼠生產基地提供［SCXK(浙)2008－0037］。研究使用的主要試劑有:Taq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶 Sau3AⅠ、DL2000 DNA Marker、DH5α 感受態細胞、pMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AXYGEN)購自杭州曉逸科技有限公司。研究使用的主要儀器有:紫外分光光度計(Thermo);PTC－200 PCR 擴增儀(Bio－rad);恒溫混勻器 Thermomixer comfort 5355(Eppendorf);水平電泳系統(GE);凝膠成像系統(UVP)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠基因組DNA的提取和酶切:采集豚鼠肌肉樣品2 g，剪碎放入1.5mL離心管，加入370mL TNE 緩沖液、100 μL 10%SDS、10 μL 的 10mg/mL蛋白酶K和20 μL的1 mol/L DTT?；靹蚝螅糜?6℃消化過夜。使用酚－氯仿－異戊醇法提取基因組DNA［11］。無水乙醇沉淀，TE緩沖液溶解后用紫外分光光度計測定濃度和純度。用限制性內切酶Sau3AⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下200～1000 bp片段，用試劑盒(Axygen)回收備用。

1.2.2 基因組片段同接頭的連接

1.2.2.1 接頭的制備:寡核苷酸鏈A(GGCCAGAGA CCCCAAGCTTCG)和B(CCGGTCTCTGGGGTTCGAA GCCTAG－PO4)由上海生工生物工程公司合成。將A、B鏈配成200 pmol/μL溶液，等比混合使終濃度為100 pmol/μL。將混合液升溫至80℃變性10 min，室溫冷卻1 h，以形成帶有限制性酶切位點(Sau3A I)的雙鏈接頭。最終形成的接頭為:

A.GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG

B.CCGGTCTCTGGGGTTCGAAGCCTAG－PO4

1.2.2.2 片段同接頭的連接:取經過回收純化的基因組DNA酶切片段和合成好的接頭進行連接，連接體系 50 μL［DNA 1.5 μg;接頭 (10 μmol/L)5 μL;10× T4 DNA Buffer 10μL;T4 DNA Ligation 3 μL;ddH2O補足］。16℃連接5 h，連接結束后，升溫至65℃滅活10 min。以此連接產物為模板，寡核苷酸鏈A為引物進行 PCR擴增，擴增體系為50 μL(模板DNA 100 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，0.3 μmol/L 寡核苷酸鏈A，1.25單位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)，反應程序為:95℃預變性4 min;94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s，共30次循環;72℃延伸 10 min。產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，如果接頭與割膠回收的DNA片段成功連接，則PCR產物將在瓊脂糖凝膠上產生約200～1000 bp的條帶。PCR產物用回收試劑盒(Axygen)純化備用。

1.2.3 雜交及磁珠捕獲重復片段

1.2.3.1 探針的合成:根據 Genbank資料設計(AC)12、(AG)12和(AAC)8三個探針，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3.2 雜交:雜交體系為100 μL(PCR富集的連接產物800 ng左右;探針 0.1 μmol/L;12×SSC 50 μL;ddH2O)，95℃變性 30 min，然后轉到 1.5mL 離心管中雜交5～6 h。各探針的雜交溫度如下:(AC)12和 (AG)12為70℃，(AAC)8為60℃。

1.2.3.3 磁珠的準備:將10 mg/mL的磁珠(Roche)在包裝瓶中混勻后取30 μL于1.5mL離心管中，加入 1× W/B buffer(10mmol/L Tris－HCl，1mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)300 μL 緩慢沖冼，用自備的磁鐵吸附管壁約1 min，分離磁珠與漂洗液，棄漂洗液。重復上述步驟2次。最后加入200 μL 1×W/B buffer備用。

1.2.3.4 片段捕獲:將100 μL雜交液加至已準備好的磁珠混合液中，43℃溫浴30 min，期間不斷振蕩，防止磁珠沉淀。然后加入 200 μL 2×SSC，0.1%SDS的溶液漂洗兩次，每次5 min;加入200 μL 1×SSC，0.1%SDS的溶液在 45℃漂洗兩次，每次5 min;加入 200 μL 1×SSC和 0.1%SDS的溶液，并于60℃漂洗兩次，每次5 min。最后一次加入60 μL TE與磁珠混勻后于95℃變性30 min后，迅速用磁鐵吸附管壁，并將含有捕獲片段的TE移至新的1.5mL離心管備用。

以含有捕獲片段的TE作為模板，再次用PCR檢測生物素標記的探針和磁珠是否捕獲了含有微衛星的目的片段(反應體系及條件同上)。PCR產物割膠回收純化，以去除多余的引物和沒有參加反應的dNTP，用紫外分光光度計檢測濃度，備用。

1.2.4 連接轉化和篩選鑒定:取PCR純化產物與pMD－18T載體連接，用熱激法將連接產物轉入DH5α感受態細胞，將感受態細胞涂布于含有氨芐青霉素、X－gal和IPTG的 LB平板培養基上，37℃培養過夜。挑選白色菌落至LB液體培養基中，37℃250 r/min振蕩培養4 h。取振蕩培養好的菌液進行PCR 檢測，10 μL 體系(菌液 1 μL，2mmol/L Tris－HCl，10mmol/L KCl，0.4mmol/L MgCl2，30 μmol/L dNTP，0.03 μmol/L 寡核苷酸 A 鏈，0.03 μmol/L 探針，0.25單位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)。PCR產物PCR擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中拍照記錄。

經鑒定為陽性克隆的菌液經再次振蕩培養后送送交上海英駿生物技術有限公司。用通用引物(M13+/M13－)進行測序。

1.2.5 引物設計與檢測

1.2.5.1 引物設計:挑選含有微衛星片段的序列，用引物設計軟件Primer Permier 5.0設計引物并送上海生工生物技術公司合成。

1.2.5.2 引物性能檢測:通過PCR反應，檢測設計合成引物在擴增過程中的穩定性和特異性。反應體系為 10 μL(模板 DNA 50 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，上、下游引物各 1 μmol/L，0.5 單位的 TaKaRa Taq DNA聚合酶)。反應程序為:95℃預變性4 min;94℃ 30 s，各引物適宜退火溫度 30 s，72℃ 30 s，共30次循環;72℃延伸10 min。

將上述擴增所得的DNA片段在1.5% 的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，用凝膠成像系統拍照記錄。

2 結果

2.1 酶切及加接頭擴增結果

選用限制性內切酶Sau3AⅠ對豚鼠基因組DNA進行酶切，結果表明，37℃ 5 h的酶切反應獲得了理想的效果(圖1)。接頭連接后PCR反應得到的片段長度主要集中在200～1000 bp范圍內(圖2)，能夠滿足實驗要求。

圖1 豚鼠基因組DNA提取結果和酶切結果圖Fig.1 Profile of the guinea pig genomic DNA and digested DNA

圖2 PCR檢測接頭連接的DNA的電泳圖譜Fig.2 Profile of the PCR testing of ligation success

2.2 磁珠富集及克隆測序結果

如果捕獲成功，則PCR產物將在瓊脂糖凝膠上產生約200～1000 bp的條帶［12］。圖3所示的結果，表明實驗中磁珠富集效果良好，泳道1～3分別為(AC)12，(AG)12，(AAC)8探針雜交捕獲的 DNA 經PCR擴增后的產物。從約2000個轉化子中獲得240個陽性克隆。以寡核苷酸鏈A和探針為引物檢測陽性克隆中是否有微衛星序列，如果PCR產物出現2條或2條以上的條帶，該克隆內可能含有微衛星插入片段［12］。如圖4 所示，泳道 1、2、3、5、7、8、9、10、11、12、13、16、18、19、20、21、24、25、26、28、29 均有可能是含有微衛星片段的陽性克隆。

圖3 PCR檢測并富集捕獲目的片段的電泳圖譜Fig.3 Profile of the PCR testing of enriched captured DNA fragments

圖4 陽性克隆PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Profile of the PCR amplification of screening for the presence of microsatellite repeats

圖5 探針雜交獲得克隆的測序結果圖Fig.5 Illustration of microsatellite－containing sequences

2.3 測序結果

挑選98個經檢驗可能含有微衛星重復序列的克隆進行測序。測序獲得的豚鼠微衛星特征序列如圖5所示。由圖5可見，測序峰明確，無雜峰，2堿基重復均大于10次，3堿基重復均大于8次。

2.4 引物設計和擴增

根據測序結果，選擇兩堿基重復單元的重復次數大于10次，三堿基重復單元的重復次數大于8次的序列用于引物設計。一共設計了35對微衛星引物。經PCR檢測后發現，其中17對引物能夠穩定地擴增出預期條帶。這17對引物的相關信息見表1。

表1 17個豚鼠微衛星位點的相關信息Tab.1 Characteristics of 17 microstellite loci of guniea pig

3 討論

一個物種微衛星位點的獲得一般有兩種方法:1)借鑒近緣物種已知的位點信息，即利用微衛星側翼序列的相對保守性，將近緣物種已知的微衛星引物用于目標物種;2)直接從該物種基因組DNA中篩選。前者快捷方便，但是前提是有相關信息可以借鑒，對于豚鼠這樣分類地位較特殊、與大部分模式生物的同源性都較低的物種，這種方法就不合適。直接從物種基因組DNA中篩選微衛星的方法可以應用于任何物種，方法也有很多［13－16］。早期的一些方法費時費力、效率低下［17］。近10年來，出現了許多新的篩選方法:基于 RAPD的 PIMA法［15］，雖然簡單快速且只需要使用PCR技術即可實現，但所得克隆的陽性率較低。而基于AFLP技術的篩選方法［16］則過于依賴富集的成效。近年來磁珠富集法被廣泛地應用于微衛星篩選研究中［17－19］，其優點在于篩選效率高、陽性克隆率高［20］。本研究選用了磁珠富集法，并在以下步驟進行了優化:(1)限制性內切酶的選擇。根據文獻資料，本研究最初選取了HaeⅢ，RsaⅠ，AluⅠ，NheⅠ和 SAU3AⅠ五種限制性內切酶進行嘗試［21］，結果發現前四種酶作用產生的DNA片段均為平末端。相比于SAU3AⅠ作用產生的粘性末端，平末端DNA片段與接頭的連接效率比較低，導致后續步驟中的PCR擴增很難得到理想的結果。經過比較，本研究最終選取了SAU3AⅠ作為唯一的限制性內切酶。(2)雜交后洗脫條件的選擇。雜交后的洗脫條件對實驗結果至關重要。一方面如果洗脫條件太過嚴謹(洗脫溫度過高、SSC濃度過低)會丟失很多含有微衛星序列的片段;另一方面如果洗脫條件太寬松(洗脫溫度過低、SSC濃度過高)則會得到很多無效片段，降低陽性克隆率。

本研究選擇磁珠富集法對實驗豚鼠進行微衛星篩選，在實驗過程中根據物種特點對實驗方案進行了優化，獲得了一套穩定、高效的篩選方法。通過這一方法成功篩選得到17對豚鼠微衛星位點。這一套分子標記可以用于實驗豚鼠遺傳分析和多樣性鑒定，成為實驗豚鼠種群遺傳檢測和遺傳育種的有力工具。

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Microsatellite Enrichment by Magnetic Beads in Guinea Pig(Cavia porcellus)

ZHU Liang，CAI Yue－qin，TU Jue，YING Hua－zhong，XU Jian－qin，CHEN Min－li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To isolate microsatellite loci from guinea pig(Cavia porcellus)genome.Methods The 200～1000 bp DNA fractions of guniea pig containing microsatellite sequences were captured by hybridization with the oligonucleotide probes attached to streptavadin coated magnetic beads.The enriched DNA were ligated into pMD－18T and then transformed into E.coli DH5α competent cells.The method of PCR was used to screen positive clones from the libraries.And microsatellite primers were disigned based on the sequences from the positive clones.Results In total 240 positive clones were identified from about 2000 transformants in the libraries screened by PCR.Finally，we got 98 sequences and successfully designed 17 pairs of microsatellite primers for guniea pig.Conclusions The results showed that this method is very efficient to isolate microsatellite markers and the markers are useful tools for further studies on guinea pig genetics.

Guinea pig;Magnetic beads enrichment;Microsatellite

R394

A

1671－7856(2010)06－0029－06

2010－01－06

浙江省科技廳實驗動物公共服務平臺項目(2008F80024)。

朱亮(1978－)，女，助理研究員，博士，研究方向:動物分子遺傳。E－mail:tozhuliang@126.com