呼吸道合胞病毒感染兔呼吸系統(tǒng)組織病理學(xué)的改變和相關(guān)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)的建立

岳盈盈，李 鵬，李志會，宋楠楠，紀 璇，孟 紅

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點實驗室，濟南 250062)

呼吸道合胞病毒感染兔呼吸系統(tǒng)組織病理學(xué)的改變和相關(guān)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)的建立

岳盈盈，李 鵬，李志會，宋楠楠，紀 璇，孟 紅

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點實驗室，濟南 250062)

目的 探討RSV感染兔呼吸系統(tǒng)的組織病理學(xué)改變及其病理學(xué)指數(shù)評估方法。方法 將RSV 100 μL(108TCID50/mL)鼻腔接種新西蘭兔，分別于3和5 d時處死動物，取鼻黏膜、氣管、肺門支氣管、肺組織做石蠟包埋切片、HE染色，與正常對照組比較，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。根據(jù)病變程度、參考相關(guān)文獻，制定鼻黏膜、氣管/支氣管、肺組織的病理學(xué)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)并進行評分。結(jié)果 與正常對照組相比，接種病毒動物可見鼻黏膜增厚甚至可見壞死脫落灶、單個核細胞浸潤以及淋巴樣組織增生;氣管、支氣管黏膜增厚、粗糙、排列紊亂，有壞死脫落，支氣管內(nèi)可見滲出物;肺組織以肺門部位病變顯著，可見以圍繞支氣管或血管組織為主的炎細胞浸潤灶，肺泡內(nèi)、各級細支氣管內(nèi)存在炎性分泌物;接種 RSV5 d組病理學(xué)指數(shù)評分與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 RSV鼻腔接種新西蘭兔可致其鼻黏膜、氣管、支氣管及肺組織發(fā)生炎性損傷。我們制定的鼻黏膜、氣管/支氣管、肺組織的病理學(xué)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)適用于動物呼吸系統(tǒng)炎性損傷程度的評估。

RSV;兔;呼吸系統(tǒng);組織病理學(xué)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒之一，世界衛(wèi)生組織早就將開發(fā)RSV疫苗、抗病毒藥物研究列為重要發(fā)展計劃，但目前仍無安全有效的疫苗和治療藥物。同時，一些流行病學(xué)調(diào)查證實早期的RSV感染與患兒以后的哮喘發(fā)作存在密切聯(lián)系［1］，但其機制目前尚不清楚。動物模型是上述研究的基礎(chǔ)，目前研究RSV主要依賴小鼠－肺炎模型，本文將RSV感染新西蘭兔，描述了其鼻黏膜、氣管、支氣管及肺組織的病理學(xué)改變，為建立新西蘭兔RSV－呼吸道感染模型提供資料。同時根據(jù)病變程度、參考相關(guān)文獻［2，3］，制定了鼻黏膜、氣管/支氣管、肺組織的病理學(xué)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)，為評判動物呼吸系統(tǒng)炎性損傷程度提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物:健康成年雄性新西蘭兔，體重1.5 kg，購于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所［SCXK(魯)20040013］。

1.1.2 Hep－2傳代細胞系:本實驗室保存。

1.1.3 RSV毒株:A2株，引自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，本科室保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒懸液制備:RSV毒株接種于Hep－2細胞上，在細胞病變達到80%時收獲，反復(fù)凍融3次，4℃離心(2000 r/min，10 min)，收集病毒懸液，滴定病毒TCID50后用于動物試驗。

1.2.2 動物試驗:新西蘭兔18只，隨機分為3組，每組6只，分別為正常對照組、病毒感染3 d組和病毒感染5 d組。正常對照組動物乙醚麻醉下鼻腔滴入生理鹽水 100 μL，50 μL/孔;其余動物乙醚麻醉后鼻腔內(nèi)緩慢滴入108 TCID50/mL病毒懸液100 μL，50 μL/孔。動物實驗室溫度(25 ±2)℃ 。每日觀察動物進食、活動情況，有無流涕、噴嚏及搔鼻現(xiàn)象。接種病毒動物分別于第3天、5天終止試驗。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測:按照文獻順序［4］取鼻黏膜、氣管、支氣管及肺組織放入4%甲醛固定。常規(guī)取材后，進行梯度乙醇脫水、組織透明處理、浸蠟、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)改變，同時根據(jù)病變程度、參考相關(guān)文獻［2，3］，對鼻黏膜、氣管/支氣管、肺組織進行病理學(xué)指數(shù)評分。指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)見表1～3。

表1 鼻黏膜組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The pathology score standard of nasal mucosa

表2 氣管、大支氣管組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 The pathology score standard of trachea and bronchus

表3 肺臟組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 The pathology score standard of lung tissue

2 結(jié)果

2.1 動物一般癥狀觀察

實驗組兔進食、活動與對照組無明顯差別，無流涕、噴嚏、呼吸急促等呼吸道感染癥狀。

2.2 組織學(xué)觀察(圖1～5見彩插4)

正常對照組鼻黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜假復(fù)層上皮細胞及其纖毛排列有序、連續(xù)，無脫落，未見杯狀細胞，偶見淋巴樣組織增生(圖1);氣管組織層次清晰，黏膜上皮細胞及其纖毛排列整齊，腔內(nèi)未見滲出物(圖2);支氣管、小支氣管層次分明，黏膜柱狀上皮細胞排列有序，纖毛上偶見極少量粘附物，管腔內(nèi)外未見炎性細胞浸潤灶，腔內(nèi)偶見分泌物，滲出物中夾帶脫落上皮;肺泡組織清晰，肺泡壁無增厚，無異常浸潤或增生。

接種 RSV3d兔鼻黏膜、器官/支氣管組織未見明顯病理學(xué)改變。

接種RSV5d兔的鼻黏膜可見上皮及其纖毛排列紊亂、水腫、增厚，時見變性、壞死缺失脫落，淋巴樣組織增生明顯，可見杯狀細胞。甚者可見鼻黏膜及黏膜下組織嚴重單個核細胞浸潤灶、變性壞死灶(圖3);氣管纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，纖毛長短不齊，表面黏附物增多，有時可見指狀突起、增生、脫落，脫落處裸露出黏膜下層，黏膜層及黏膜下層有散在單個核細胞浸潤，腔內(nèi)分泌物增多，分泌物中可見紅細胞或單個核細胞浸潤(圖4);支氣管、小支氣管可見上皮排列紊亂、炎性細胞浸潤、嚴重增生、增厚，管腔內(nèi)多見脫落壞死組織和炎性浸出;肺內(nèi)各級支氣管內(nèi)多見滲出液，液體中可伴有單個核細胞的滲出，有時分泌物充滿管腔，多見大量單個核細胞圍繞細支氣管和血管周圍呈套袖狀灶性浸潤(圖5)，肺泡壁增厚，可見單個核細胞浸潤，時見肺泡內(nèi)滲出液。

2.3 病理評分

經(jīng)t檢驗，與正常對照組比較，在鼻黏膜組織病理評分，氣管、大支氣管組織病理評分以及肺臟組織病理評分上，RSV3 d組差異都不顯著(P＞0.05);RSV5 d組差異都極其顯著(P＜0.01)(表4～6)。

表4 鼻黏膜組織病理評分(±s，n=5)Tab.4The pathology score of nasal mucosa(±s，n=5)

表4 鼻黏膜組織病理評分(±s，n=5)Tab.4The pathology score of nasal mucosa(±s，n=5)

Epithelium 0 0.4±0.55 1.8±0.84增生 Hyperplasia 0 0 1.8±0.84腺體增生Hyperplasia of gland 0 0.2±0.45 1±0.71炎性浸潤Inflammatory infiltration 0 0.4±0.55 1.6±0.55變性壞死Degeneration and necrosis 0 0 0.6±0.89淋巴樣組織增生Lymphoid hyperplasia 0 0 1.6±0.55評分RSV5 d group黏膜上皮正常對照組Control group 感染RSV 3 d組RSV3 d group 感染RSV 5 d組Score 0 2.6±2.88 15.2±4.44

表5 氣管、大支氣管組織病理評分(±s，n=5)Tab.5The pathology score of trachea and bronchus(±s，n=5)

表5 氣管、大支氣管組織病理評分(±s，n=5)Tab.5The pathology score of trachea and bronchus(±s，n=5)

RSV5 d group柱狀纖毛上皮Stylolitic ciliated epithelium 0 0.4±0.55 2.正常對照組Control group 感染RSV 3d組RSV3 d group 感染RSV5 d組2±0.84腺體細胞Hyperplasia of gland 0 0.2±0.45 1.8±0.84管腔內(nèi)分泌物luminal sectetion 0 0.2±0.45 1.8±0.45炎性細胞浸潤Inflammatory infiltration 0 0.2±0.45 2.0±0.71評分Score 0 1.8±2.05 12.2±3.03

表6 肺臟組織病理評分(±s，n=5)Tab.6The pathology score of lung tissue(±s，n=5)

表6 肺臟組織病理評分(±s，n=5)Tab.6The pathology score of lung tissue(±s，n=5)

RSV5 d group細支氣管周圍、支氣管浸潤部位(%)Infiltrative domain around bronchioles and bronchi(%)正常對照組Control group 感染RSV 3 d組RSV3 d group感染RSV 5 d組0 0.6±0.55 2.0±0.71細支氣管、支氣管周圍浸潤的定性Infiltratie qualitation around bronchioles and bronchi 0 0.4±0.55 1.8±0.45細支氣管支氣管腔滲出Exudation in bronchioles and bronchi 0.4±0.55 0.2±0.45 1.4±0.55血管周圍浸潤Infiltration around blood vessel 0 0.2±0.45 1.8±0.84間質(zhì)性肺炎Interstitial pneumonia 0 0.2±0.45 1.2±0.45評分Score 1.2±1.64 2.8±3.83 14.6±4.16

3 討論

RSV是人類呼吸系統(tǒng)常見的病原，建立動物病毒感染模型是研究其感染機理、疫苗、抗病毒藥物等的重要工具。本文以RSV感染新西蘭兔，觀察了鼻黏膜、氣管/支氣管及肺組織的病理學(xué)改變，為建立RSV－呼吸道感染兔模型提供資料。

將RSV接種兔鼻腔3 d時組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，動物鼻黏膜、氣管/支氣管、肺組織尚無明顯炎性損傷，而5 d時動物呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)病理學(xué)改變，鼻腔黏膜可見纖毛上皮排列紊亂，淋巴樣組織和杯狀細胞增生，甚者出現(xiàn)變性壞死灶，氣管/支氣管黏膜出現(xiàn)指狀突起、增生、脫落、炎性細胞浸潤，腔內(nèi)分泌物增多;支氣管、小支氣管管腔內(nèi)多見脫落壞死組織和炎性浸出，肺泡及肺內(nèi)各級支氣管內(nèi)出現(xiàn)典型支氣管肺炎改變，表明接種RSV雖然沒有觀察到顯著的臨床癥狀，但5 d時造成了兔呼吸系統(tǒng)的炎性損傷。

本文參考相關(guān)文獻，對RSV感染兔造成的呼吸系統(tǒng)損傷進行了指數(shù)評估。肺臟炎性損傷評分標(biāo)準(zhǔn)搬用了 Martin的方法［2］，將細支氣管/支氣管周圍浸潤部位(%)、細支氣管/支氣管周圍浸潤的定性、細支氣管/支氣管腔滲出、血管周圍浸潤及間質(zhì)性肺炎作為評價指標(biāo)，其中將細支氣管/支氣管周圍浸潤的定性和細支氣管/支氣管腔滲出做了3倍加權(quán)，以突出其在損傷中的重要地位。根據(jù)該資料以及大鼠對鼻黏膜損傷評分資料，本論文對鼻黏膜和氣管組織的損傷做了指數(shù)評估，其中評價鼻黏膜損傷即將黏膜上皮、增生、腺體、炎性浸潤、變性壞死及淋巴樣組織增生作為指標(biāo)，將黏膜上皮損傷和炎性浸潤做了3倍加權(quán);評價氣管組織的損傷即將柱狀纖毛上皮、腺體細胞、管腔內(nèi)分泌物及炎性細胞浸潤作為指標(biāo)，將柱狀纖毛上皮做了3倍加權(quán)，這樣獲得病理損傷指數(shù)。RSV 5 d組與正常對照組比較，差異顯著，說明上述指數(shù)計算方法可用于對兔呼吸系統(tǒng)損傷程度的評估。

從RSV發(fā)現(xiàn)至今，人們已采用黑猩猩、獼猴［3］、雪貂、牛、棉鼠、棉兔、豚鼠和小鼠［5，6］等動物建立感染模型。目前小鼠、豚鼠肺感染模型是主要研究工具。從本論文資料分析，新西蘭兔對RSV的易感性較高，感染后炎性反應(yīng)強烈，取材方便、血清量大，可對呼吸系統(tǒng)多部位炎性損傷進行分析評價，易于做多項指標(biāo)分析，所以新西蘭兔感染模型更適于疫苗效果評價、藥效等研究。

綜上所述，本文以RSV感染新西蘭兔，致其鼻黏膜、氣管、支氣管及肺組織產(chǎn)生病理學(xué)改變，為建立RSV－呼吸道感染兔模型提供資料，為客觀評價抗RSV制劑效果和研究免疫功能不全個體RSV感染致病機制奠定基礎(chǔ)。

［1］Sicurs N，Bjarnason R，Sicurbercsson F，et al.Respiratory syncytial virus bronchiolitis in infancy is an important risk factor for asthma and allergy at age 7［J］.Am J Repir Crit Care Med，2000，161:1501－1507.

［2］Martin RJ，Chu HW，Honour JM.Airway in flammation and bronchial hypersponsiveness after mycoplasma pneumoniaw infection in a murine model［J］.J Am J Reapir Cell Mol Biol，2001，24:577.

［3］McArthur－Vaughan K，Gershwin LJ.A rhesus monkey model of respiratory syncytial virus infection［J］.J Med Primatol，2002，31(2):61－67.

［4］高青.實驗動物病理標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化取材和量化診斷方法［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(3):內(nèi)4.

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［6］李燕暉，李保剛.中、重癥呼吸道合胞病毒感染 BALB/c小鼠模型的實驗研究［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，(4):14－16.

Research of the Histopathological Change of Rabbits Infected by Respiratory Syncytial Virus and Establishment of a Pathology Index Score Standard

YUE Ying－ying，LI Peng，LI Zhi－h(huán)ui，SONG Nan－nan，JI Xuan，MENG Hong
(Institute of Basic Medical Sciences of Shandong Academy of Medical Science，Key Laboratory for Mordern Medicine and Technology of Shandong Province，Jinan 250062，China)

Objective To investigate the histopathology change of respiratory system in rabbits which infected by respiratory syncytial virus，and to establish a pathology index score standard.Methods The rabbits were inoculated respiratory syncytial virus 100 μL(108TCID50/mL)by intranasal ，and executed at 3 or 5 days respectively.The nasal mucosa，trachea/bronchus and lung tissues were obtained to observe the histopathology change.According to the level of pathological changes，a pathology index score standard of the nasal mucosa，trachea/bronchus and lung tissues was established.Results Compared with normal control，the respiratory system of model group had evident histopathology change.The nasal mucosa increased thickness and had necrosis desquamation，mononuclear cell infiltration and lymphoid hyperplasia.The mucous membrane of trachea and bronchus increased thickness，asperity，derangement，and had necrotic desquamation.There were exudates in the bronchus.The portopulmonary and lung tissue had evident pathological changes.There were phagocyte infiltration focuses which around the bronchus and vascular.Bronchioles and pulmonary alveoli were filled with inflammatory secretion.Compared with normal control，the pathology index scores of RSV5d group showedstatistical significance.Conclusion The rabbits which were inoculated respiratory syncytial virus by intranasal could emerge inflammatory damages in their nasal mucosa，trachea，portopulmonary bronchus and lung tissue.Our pathology index score standard could apply to evaluation the degree of inflammatory injury of animal respiratory system.

Respiratory syncytial virus;Rabbit;Respiratory system;Histopathology

圖1 正常對照組鼻黏膜Fig.1 The nasal mucosa of control group

圖2 正常對照組氣管組織Fig.2 The trachea of control group

圖3 感染RSV第5天兔炎性鼻黏膜Fig.3 The nasal mucosa of model group at the 5th day

圖4 感染RSV第5天兔炎性氣管組織Fig.4 The trachea of model group at the 5th day

圖5 感染RSV第5天兔炎性支氣管及肺組織Fig.5 The bronchus and lung tissue of model group at the 5th day

R373.1

A

1671－7856(2010)06－0021－05

2010－01－19

岳盈盈，碩士，助理研究員。E－mail:yyy0513@163.com

孟紅。E－mail:menghyky@yahoo.com.cn