金屬離子Cu2+、Ca2+和Mg2+對抗蚜威與DNA結合作用的影響

胡 興，張國文,*，付 鵬，占春瑞

金屬離子Cu2+、Ca2+和Mg2+對抗蚜威與DNA結合作用的影響

胡 興1，張國文1,*，付 鵬1，占春瑞2

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西出入境檢驗檢疫局，江西 南昌 330002)

在人體生理酸度(pH7.4)下，運用紫外、熒光光譜法和DNA熔點實驗研究抗蚜威與小牛胸腺DNA的作用方式以及Cu2+、Ca2+和Mg2+分別對兩者結合的影響。溴化乙錠(EB)競爭實驗和DNA熔點測定結果表明，抗蚜威主要是通過嵌插方式與DNA堿基發生作用。3種金屬離子均能與抗蚜威絡合，絡合物的生成使體系的紫外吸收峰強度和形狀發生改變，并能不同程度地猝滅DNA-EB復合物的熒光；Cu2+、Ca2+的存在使DNA-抗蚜威復合物的結合常數呈現先減弱后增強的趨勢，而Mg2+的參與能增強兩者之間的結合。由此推斷出，金屬離子對抗蚜威與DNA結合的影響主要取決于金屬離子與DNA的堿基和磷酸基團間結合的相對親和比。

金屬離子；抗蚜威；小牛胸腺DNA；熒光光譜；嵌插作用

DNA是生命遺傳信息的主要載體，也是化學物質作用于生物體的一個重要靶標[1-2]。化學物質與DNA之間的非共價鍵結合方式主要有靜電結合、溝槽結合和嵌插結合[3]。已有文獻報道金屬離子能夠參與藥物分子與DNA的結合過程[4]。Cu2+、Ca2+和Mg2+是細胞內主要的二價金屬離子(Me2+)，在細胞體內充當各種重要角色，許多重要的遺傳過程需要金屬離子的協助才能發揮正常功能[5-7]。

抗蚜威(pirimicarb)是目前農業生產中廣泛使用的一種氨基甲酸酯類農藥，美國環境保護署(EPA)2008年發布的致癌可能性的農藥名錄，抗蚜威被列為可能對人類具有致癌性農藥[8]。DNA是許多農藥在體內的主要靶分子，某些農藥分子通過與正常細胞DNA發生加合作用破壞其結構，進而影響基因調控與表達的功能。目前，農藥抗蚜威與DNA作用方式及金屬離子對抗蚜威與DNA結合的影響尚未見報道。本實驗采用紫外、熒光光譜法和熔點實驗，研究抗蚜威與DNA的結合作用以及Cu2+、Ca2+和Mg2+對其結合作用的影響，期望為進一步研究抗蚜威的毒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

抗蚜威標準品(用95%的乙醇配制，得溶液濃度為8.39×10-4mol/L，使用時根據所需進行稀釋)；小牛胸腺DNA(以下簡稱DNA，用0.1mol/L的NaCl溶液溶解，濃度利用ε260=6600L/(mol·cm)來確定，溶液于4℃的冰箱中儲備)由北京華美生物工程有限公司提供；溴化乙錠(EB)配制成1.0×10-3mol/L的水溶液，使用時根據所需進行稀釋；1.0mol/L的NaCl溶液；0.05mol/L的Tris-HCl (pH7.4)緩沖溶液；其他試劑均為分析純；實驗用水均為二次蒸餾水。

F-4500型熒光光度計 日本日立公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHS-3C型酸度計上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜測定

在10mL的比色管中，加入4.0mL Tris-HCl緩沖溶液后再加入30μL 8.39×10-4mol/L的抗蚜威，定容至10mL混勻。移取此溶液各3mL于比色皿中，測量其紫外光譜后再逐次分別加入8μL 0.1mol/LCu2+、Ca2+和Mg2+溶液，測定紫外光譜，并扣除背景空白吸光度。

1.2.2 熒光光譜測定

在10mL的比色管中，加入4.0mL Tris-HCl緩沖溶液及20μL 8.39×10-4mol/L的抗蚜威后，再分別加入一系列濃度的Cu2+、Ca2+、Mg2+溶液，定容至10mL混勻。準確移取此溶液各3mL于熒光池中，測量其熒光強度后，分別用等量DNA(16μL/次，溶液中DNA的最終濃度為1.02×10-4mol/L)進行熒光滴定，測定其熒光強度。上述測定激發和發射狹縫均為5nm。

2 結果與分析

2.1 抗蚜威與金屬離子的相互作用

圖1 Cu2+(a)、Ca2+(b)和Mg2+(c)存在下抗芽威的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of pirimicarb in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+and absence of metal ions

圖1 是Cu2+、Ca2+、Mg2+分別加入到抗蚜威中的紫外光譜(扣除了背景空白)。Cu2+、Ca2+、Mg2+的加入均使抗蚜威體系產生不同程度的增色效應，且Cu2+的增色最大，表明3種金屬離子均與抗蚜威發生了絡合[9]。

2.2 金屬離子、抗蚜威競爭置換EB與DNA結合實驗

圖2 3種金屬離子對DNA-EB復合物的熒光影響Fig.2 Fluorescence spectra of the EB/DNA complex in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+and absence of metal ion

EB是一種典型的嵌入式熒光探針，它本身的熒光強度很弱，但當其生色團平行地嵌入雙螺旋DNA的堿基對中可使熒光顯著增強[10]。向EB溶液中分別加入Cu2+、Ca2+、Mg2+、抗蚜威溶液時，體系的熒光光譜幾乎沒有發生變化，表明在實驗條件下EB與金屬離子和抗蚜威并不發生結合反應。而分別用3種金屬離子滴定DNA-EB混合溶液，3種離子均能對DNA-EB體系的熒光產生一定程度的猝滅(圖2)，猝滅程度為Cu2+＞Ca2+＞Mg2+。文獻[11]報道Cu2+、Ca2+可以與DNA的磷酸基團和堿基對結合，且結合能力Cu2+＞Ca2+，而Mg2+與DNA堿基的親和能力很小，主要是與DNA的磷酸基團結合。由本實驗結果推測，Cu2+、Ca2+可能與EB競爭DNA的結合位點，而導致DNA-EB體系的熒光猝滅，熒光猝滅程度可能和金屬離子與DNA堿基結合能力的強弱有關。用抗蚜威代替金屬離子滴定DNA-EB混合溶液，圖3表明，隨著體系內抗蚜威濃度在一定范圍內的增加，DNA-EB體系的熒光強度逐漸猝滅，說明抗蚜威與EB競爭結合DNA的同一位點，而置換出DNA-EB復合物中的EB，從而使體系的熒光強度降低，表明抗蚜威與DNA之間發生了嵌插作用。

圖3 抗蚜威對DNA-EB復合物的熒光影響Fig.3 Fluorescence spectra of the EB/DNA complex in the presence of different concentrations of pirimicarb

2.3 熔點實驗

圖4 金屬離子對DNA-抗蚜威熔點的影響Fig.4 Effects of Cu2+, Ca2+and Mg2+on the melting point of the EB/DNA complex

通常把DNA的雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為該DNA的溶解溫度或熔點(Tm)。小分子與DNA的相互作用對Tm有影響，嵌插結合使得DNA雙螺旋結構更加穩定，Tm會增加5～8℃，而溝槽結合或靜電結合對Tm影響不明顯[12]。在Cu2+、Ca2+、Mg2+的人體生理離子濃度下[13]，分別測定DNA、DNA-抗蚜威體系在不同溫度下的吸光度。在40～100℃溫度范圍內，作fss= (A－A0)/(Af－A0)對溫度T的熱變性曲線(圖4，A0和Af分別為40℃和100℃時體系的吸光度，A為溫度變化對應的吸光度)，求得DNA的Tm為67.2℃，DNA-抗蚜威體系的Tm為75℃，升高了7.8℃，進一步說明抗蚜威與DNA以嵌插方式結合，抗蚜威嵌入到DNA堿基對之間，使得DNA雙螺旋結構更加穩定。Cu2+、Ca2+、Mg2+分別存在下，DNA-抗蚜威體系的Tm為78℃左右，Tm增加值小于5℃，表明3種離子的參與均未影響抗蚜威與DNA的結合方式。

2.4 金屬離子對DNA-抗蚜威體系結合常數的影響

圖5 不同金屬離子濃度對抗蚜威-DNA體系結合常數的影響Fig.5 Effect of Cu2+, Ca2+and Mg2+at different concentrations on the binding constant of the pirimicarb/DNA complex

在不同濃度Cu2+、Ca2+、Mg2+存在下，分別用DNA滴定抗蚜威，體系的熒光光譜均發生了不同程度猝滅。采集熒光猝滅數據，由方程lg[(F0－F)/F]=lgK +nlg[Q][14]，求得不同濃度的金屬離子存在下抗蚜威與DNA之間的結合常數，如圖5所示。Hackl等[11]研究結果證明：Cu2+和Ca2+與DNA的磷酸基團和堿基都可以結合，且與堿基的結合能力更強。結合本實驗2.2節和圖5結果，可以得出當Cu2+(＜2.6 ×10-3mol/L)和Ca2+(＜2.8×10-3mol/L)處于低濃度時，Cu2+、Ca2+主要與DNA的堿基結合，它們與抗蚜威發生了競爭作用，從而減小了DNA-抗蚜威體系的結合常數。而當Cu2+(＞2.6×10-3mol/L)和Ca2+(＞2.8×10-3mol/L)處于高濃度時，Cu2+、Ca2+先與抗蚜威絡合，再通過離子橋作用于DNA的磷酸基團結合，形成DNA-抗蚜威-Cu2+或DNA-抗蚜威-Ca2+復合物使結合常數明顯增大；而Mg2+與DNA堿基的親和能力很小，主要是與DNA的磷酸基團結合，當Mg2+在其與核苷酸作用的時候，嘌呤的 N7 位會取代其中一個水配體，其余水配體能與磷酸上的氧以及嘌呤C6位上的O形成氫鍵[15]，Mg2+的參與有利于DNA的雙螺旋打開，從而促進抗蚜威與DNA的結合，表現為增大了抗蚜威與DNA的結合常數[16]。

3 結 論

紫外光譜表明，Cu2+、Ca2+和Mg2+都能與抗蚜威絡合，EB競爭實驗和DNA熔點實驗表明，抗蚜威與DNA以嵌插方式結合。金屬離子對DNA-抗蚜威結合的影響程度主要取決于金屬離子與DNA堿基和磷酸基團間結合的相對親和比。當Cu2+、Ca2+在低濃度時，其主要與DNA的堿基結合，此時Cu2+、Ca2+通過競爭抗蚜威與DNA的結合位點而導致DNA-抗蚜威之間的結合常數降低，在高濃度時通過Cu2+、Ca2+離子橋作用增大了DNA-抗蚜威之間結合常數，而Mg2+主要與DNA的磷酸基團結合，Mg2+濃度的增加能增加抗蚜威與DNA之間的結合常數。

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Effects of Cu2+, Ca2+and Mg2+on the Interaction of Pirimicarb with Calf Thymus DNA

HU Xing1，ZHANG Guo-wen1,*，FU Peng1，ZHAN Chun-rui2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanchang 330002, China)

The interaction between pirimicarb and calf thymus DNA was studied by UV absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy and melting point measurement in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+in physiological buffer (pH 7.4). From the results of ethidium bromide (EB) competition and DNA melting point measurement, pirimicarb reacted with DNA basic groups mainly through intercalative binding. All the three metal ions were found to be able to complex with pirimicarb, and the generation of complexes made a difference to the ultraviolet absorption peak intensity and shape of the reaction systems and quenched the fluorescence intensity of the EB/DNA complex to different extents. In the respective presence of Cu2+and Ca2+, the binding constant of the DNA/pirimicarb complex initially decreased, followed by increase, and the involvement of Mg2+could enhance the binding between DNA and pirimicarb. It can be concluded that the binding between DNA and pirimicarb mainly depends on the relative affinity ratio between metal ions and DNA basic groups or phosphate groups.

metal ions；pirimicarb；calf thymus DNA；fluorescence spectrum；intercalative binding

O657.3

A

1002-6630(2010)19-0146-04

2010-06-20

國家自然科學基金項目(31060210)；江西省科技支撐計劃項目(2009BNA09000)；國家質檢總局科技項目(2009IK141)；南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200807)

胡興(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：hx0726@126.com

*通信作者：張國文(1966—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學與食品安全。 E-mail：gwzhang@ncu.edu.cn