肉味香基中的抗氧化物質的分離及抗氧化活性

汪何雅，于汐洋，錢 和*，姚衛蓉

肉味香基中的抗氧化物質的分離及抗氧化活性

汪何雅，于汐洋，錢 和*，姚衛蓉

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

目的：對肉味香基中具有抗氧化活性的成分進行分離，探討其結構和功能之間的關系。方法：利用膜分離和色譜分離手段對肉味香基中抗氧化成分進行分離，考察各組分對AAPH和Fe3+/VC誘導的卵磷脂脂質體氧化以及脂質體自動氧化的抑制效果。結果：根據分子質量將肉味香基分離得到3個分子質量段的美拉德反應產物(MRPs)，其中高分子質量MRPs(H-MRPs)抗氧化活性最強；H-MRPs進一步分離得到H-MA、H-MB、H-MC 3類組分，極性由弱到強為：H-MA＜H-MB＜H-MC，抗氧化能力從高到低為：H-MA＞H-MB＞H-MC。結論：肉味香基中主要發揮抗氧化作用的組分是高分子質量MRPs，并且其極性越弱，抗氧化能力越強。

肉味香基；抗氧化；美拉德反應產物(MRPs)；卵磷脂脂質體(LPS)

通過氨基酸或植物蛋白水解物與還原糖高溫加熱發生美拉德反應(Maillard reaction)，制備得到的反應型肉味香基，其香味逼真，成本低廉，是開發咸味香精必不可少的配料，主要用于方便面調料、雞精、罐頭、熏肉、醬肉、香腸、火腿腸、香辣醬等食品以及動物飼料和寵物食品[1]，以增加或賦予食品肉風味，滿足人們對肉風味的需要。美拉德反應是在食品加工和儲存過程中氨基酸或蛋白質和碳水化合物發生的一系列復雜反應，它是食品烹調和加工過程中產生食品風味和食品色澤的重要途徑。許多研究表明氨基酸-還原糖、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)具有抗氧化功能[2-5]。MRPs的抗氧化功能主要來源于有色物類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環化合物，其中的某些物質的抗氧化能力能達到常用抗氧化劑同樣的水平，如在高脂類食品中加入MRPs產物能抑制脂類氧化[6]。近年來，針對氨基酸-還原糖高溫反應產物、面包皮提取物、咖啡提取物以及高溫加熱膳食中存在的MRPs的抗氧化性已有大量研究，但對于咸味香精中MRPs的抗氧化功能還未見報道。本研究以咸味香精調配前的肉味香基為對象，利用膜過濾和色譜分離手段對肉味香基中抗氧化成分進行分離，探討肉味香基中抗氧化成分的結構和活性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉味香基 國內某香精公司；MWCO 8000～14000透析袋、GF254薄層硅膠板、硅膠(100～200目) 國藥集團化學試劑有限公司；MWCO 1000超濾膜片 無錫賽普膜科技有限公司。

大豆卵磷脂(純度98%)、2,2 -鹽酸脒基丙烷(AAPH，純度98%) Sigma公司；硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸(VC)均為化學純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UF201超濾設備 無錫賽普膜科技有限公司；R-501旋轉蒸發器 上海申順生物科技有限公司；YD-900L超聲波細胞粉碎機 上海之信儀器有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器 常州國華電器有限公司；WFJ7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 肉味香基中抗氧化成分的初步分離

稱取肉味香基，稀釋、抽濾得澄清液體。4℃去離子水透析，直到透出液呈無色透明，未透出液記為H-MRPs(＞14kD)，冷凍干燥備用。濃縮透出液，利用截留分子質量1kD的超濾膜進行超濾分離(使用壓力0.5MPa)，收集滯留液及濾液，分別記為M-MRPs(1～14kD)、L-MRPs(＜1kD)，冷凍干燥備用。

1.4 硅膠柱層析分離純化H-MRPs

稱量100～200目硅膠100g，加入一定量的95%乙醇充分攪拌成勻漿。將硅膠邊攪拌邊緩緩倒入層析柱(25mm×200mm)中，待硅膠沉積后，再加入95%乙醇使床層壓實。稱取一定量的H-MRPs，配成質量濃度為10mg/mL的溶液，濕法上樣2～3mL。用洗脫劑進行洗脫，洗脫速度為0.5mL/min，每5min收集一管洗脫液，用紫外-可見分光光度計于420nm波長處檢測MRPs含量，收集洗脫液進行冷凍干燥

1.5 各組分對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

1.5.1 大豆卵磷脂脂質體(LPS)的制備

參照文獻[7]并稍加改進。大豆卵磷脂溶解于石油醚中，通過旋轉蒸發器(3500r/min，水浴35℃)和氮氣去除有機溶劑，得到均勻分散的卵磷脂薄膜，加入10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，超聲波處理15min，得到白色、乳狀的脂質體溶液LPS，LPS終質量濃度為10mg/mL。

1.5.2 各組分對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

1.5.2.1 AAPH誘導氧化

在試管中加入LPS和不同質量濃度的樣品，其中LPS終質量濃度10mg/mL，然后加AAPH(終質量濃度10mg/mL)。加樣完畢后避光于37℃水浴孵育1h，冷卻，用TBA法[8]測定脂質過氧化程度。測定步驟如下：

反應體系中加入2mL TCA-TBA-HCl(1.68g TCA和41.6mg TBA溶解于10mL 0.125mol/L HCl溶液中)，混合液于沸水浴加熱15min，迅速冷卻，5500r/min離心20min，取上清液于532nm波長處測定得到吸光度As，以重蒸水代替樣品做為空白對照，測得吸光度 Ac。按下式計算樣品對脂質體過氧化的抑制率。

1.5.2.2 Fe3+/VC誘導氧化[9]

試管中依次加入1mL LPS、1mL 400μmol/L FeCl3、1mL 400μmol/L VC和1mL樣品，混勻。避光并于37℃水浴加熱60min，冷卻。脂質過氧化程度的測定方法同1.5.2.1節。

1.5.2.3 自動氧化

試管中加入LPS，避光并于37℃水浴加熱24h，冷卻。脂質過氧化程度的測定方法同1.5.2.1節。

2 結果與分析

2.1 不同分子質量MRPs的抗氧化活性

表1 肉味香基以及不同分子質量的MRPs對3種脂質過氧化體系的抑制率Table 1 Inhibitory effects of the meat flavor studied and its ultrafiltration fractions on the induced oxidation and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes %

本研究所選擇的肉味香基是通過植物蛋白水解物與還原糖高溫加熱制備得到的，是直接的美拉德反應產物。由表1可見，在3種脂質體氧化模型中，肉味香基都具有一定的抗氧化性；分離得到的3種分子質量范圍的MRPs中，高分子質量的美拉德反應產物(H-MRPs)發揮較高的抗氧化活性。早在1953年，Hodge等[10]首先報道了有關美拉德反應產物具有防止植物油氧化的效果。Franzke等[11]在1954年也發現，人造奶油中添加甘氨酸-葡萄糖反應產物后可以提高人造奶油的氧化穩定性。目前許多研究表明氨基酸-還原糖模擬體系的反應產物、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的美拉德反應產物具有抗氧化功能[2-5]。另有研究發現MRPs還具有很強的消除活性氧的能力[12]。近年來大量研究結果顯示，MRPs中起主要抗氧化、消除活性氧等作用的物質是一類高分子質量的食品類黑精[13-15]，Yoshimura等[16]初步研究葡萄糖-甘氨酸的反應產物的抗氧化能力時發現，一部分類黑精抗氧化能力甚至超過BHA和沒食子酸丙醋等。這些研究結果與本實驗結果相似。

2.2 硅膠柱層析法對H-MRPs進行分離純化

2.2.1 流動相的確定

結合文獻，根據美拉德反應產物的性質，選定以下幾組流動相：正己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯、正丁醇-水、乙醇-水，考察它們在TLC板上對H-MRPs的分離情況，結果見圖1。

圖1 各流動相體系的薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatographic profiles of the high-molecular weight fraction using different mobile phases

由圖1可知，只有正丁醇-水和乙醇-水體系能達到較佳的分離效果；而且，后者的Rf值為0.756，分離效果更好。因此，確定95%乙醇-水作為流動相來分離H-MRPs。

2.2.2 乙醇-水作為流動相分離H-MRPs

圖2 不同的乙醇-水洗脫配比對產品洗脫特性的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration gradients on further fractionation of the high-molecular weight fraction

由圖2可知，H-MRPs經硅膠柱分離得到3個組分，按洗脫得到的先后順序分別為H-MA、H-MB、H-MC。當起始洗脫劑為95%乙醇時，H-MA組分和H-MB組分得到了較好的分離；然后，加大洗脫劑的極性，進一步洗脫出組分H-MC(圖2c)。因此，選用95%乙醇-水洗脫體系對H-MRPs進行梯度洗脫，收集得到H-MA、H-MB、H-MC 3種組分，3種組分質量比為3.2:1:2.3。硅膠柱層析是根據極性不同來分離H-MRPs，由于乙醇極性小于水的極性，因此分離得到的3個組分極性由大到小為：H-MC＞H-MB ＞H-MA。2.3各組分對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

圖3 H-MRPs各組分對AAPH誘導的脂質體過氧化的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on AAPH induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

圖4 H-MRPs各組分對Fe3+/VC誘導的脂質體過氧化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on Fe3+/VC induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

圖5 各組分對脂質體自動氧化的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

由圖3～5可見，在3種脂質體氧化模型中，H-MA、H-MB和H-MC組分均具有抗氧化效果，并且它們的抗氧化活性由大到小均為：H-MA＞H-MB＞H-MC。當反應物起始質量濃度為5mg/mL時，H-MA、H-MB和H-MC組分對AAPH誘導的脂質體氧化的抑制率分別為76.07%、72.68%和70.36%；當反應物起始質量濃度增加至10mg/mL時，H-MA、H-MB和H-MC組分的抑制率分別增大至98.95%、89.57%和75.12%。并且，在3種脂質體氧化模型中，H-MA組分的抗氧化效果均顯著高于H-MRPs(P＜0.05)。因此，本實驗研究結果顯示，在H-MRPs中，極性較小的組分具有較強的抗氧化能力。

類黑精廣泛分布于人們的日常飲食之中，現在已經有學者嘗試從食品(如咖啡、黑啤酒和豆醬)中分離和純化類黑精，然而由于食品中類黑精組成的復雜性以及大量衍生化合物的生成，即使是最先進的分離手段和檢測手段也不能完全確定所有類黑精的特性。本研究顯示MRPs的極性越弱，抗氧化能力越強，該結果與秦禮康等[17]的研究結果一致。秦禮康等將陳窖豆豉類黑精按極性分離成不同組分，并對各組分的抗氧化效果進行了研究，結果發現，利用大孔樹脂S-8分離類黑精得到的無水乙醇洗脫組分，其抗亞油酸氧化能力最強，超過了類黑精粗提物。

3 結 論

肉味香基具有較強的抗氧化活性，其中主要發揮抗氧化作用的組分是高分子質量的美拉德反應產物(H-MRPs)。根據極性對H-MRPs進行進一步的分離純化，得到極性由弱到強的3個組分：H-MA、H-MB和H-MC。3個組分均具有明顯的抗氧化效果，并且其對卵磷脂脂質體氧化的抑制能力隨著其極性的增強而減弱。

[1]孫寶國. 肉味香精技術進展[J]. 食品科學, 2004, 25(10): 339-342.

[2]KIM J S, LEE Y S. Antioxidant activity of Maillard reaction products derived from aqueous glucose/glycine, diglycine, and triglycine model systems as a function of heating time[J]. Food Chemistry, 2009, 116: 227-232.

[3]DITTRICH R, DRAGONAS C, KANNENKERIL D, et al. A diet rich in Maillard reaction products protects LDL against copper-induced oxidation ex vivo, a human intervention trial[J]. Food Research International, 2009, 42: 1315-1322.

[4]SOMOZA V, LINDENMEIER M, WENZEL E, et al. Activity-guided identification of a chemopreventive compound in coffee beverage using in vitro and in vivo techniques[J]. Agric Food Chem, 2003, 51(23): 6861-6869.

[5]SOMAZA V, WENZEL E, LINDENMEIER M, et al. Influence of feeding malt, bread crust, and a pronylated protein on the activity of chemopreventive enzymes and antioxidative defense parameters in vivo [J]. Agric Food Chem, 2005, 53(21): 8176-8182.

[6]尤新. 氨基酸和糖類的美拉德反應: 開發新型風味劑和食品抗氧化劑的新途徑[J]. 食品工業科技, 2004, 25(7): 138-139.

[7]ALEJANDRA N C, LIDIA L P, GRACIELA B, et al. Antioxidant effects of water-and lipid-soluble nitroxide radicals in liposomes[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2004, 37(12): 2042-2051.

[8]YILMAZ Y, TOLEDO R. Antioxidant activity of water-soluble Mailllard reaction products[J]. Food Chemistry, 2005, 93(2): 273-278.

[9]項惠丹, 許時嬰, 王璋. 蛋白質與還原糖美拉德反應產物的抗氧化活性[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 52-57.

[10]HODGE J E, RIST C E. The Amadori rearrangement under new conditions and its significance for non-enzymatic browning reactions[J]. Journal of the American Chemical Society, 1953, 75: 316-322.

[11]FRANZKE C, IWAINSKY H. Anitioxidant capacity of melanoidin[J]. Dtsch Lebensm, Rundsch, 1954, 50: 251-254.

[12]YEN G C, HSIEH P P. Antioxidative activity and scavenging effects on active oxygen-lysine Maillard reaction products[J]. Sci Food Argic, 1995, 67: 415-420.

[13]XU Qingping, TAO Wenyi, AO Zonghua. Antioxidant activity of vinegar melanoidins[J]. Food Chemistry, 2007, 102(3): 841-849.

[14]GOYA L, DELGADO-ANDRADE C, RUFIAN-HENARES J A, et al. Effect of coffee melanoidin on human hepatoma HepG2 cells. Protection against oxidative stress induced by tert-butylhydroperoxide[J]. Mol Nutr Food Res, 2007, 51(5): 536-545.

[15]LINDENMEIER M, FAIST V, HOFMANN T. Structural and functional characterization of pronyl-lysine, a novel protein modification in bread crust melanoidins showing in vitro antioxidative and phase I/II enzyme modulating activity[J]. Agric Food Chem, 2002, 50(24): 6997-7006.

[16]YOSHIMURA Y, IIJIMA T, WATANABLE T, et al. Antioxdative effect of Maillard reaction products using glucose-glycine model system[J]. J Agric Food Chem, 1997, 45(10): 4106-4109.

[17]秦禮康, 丁霄霖. 陳窖豆豉粑類黑精組分體外抗氧化活性研究[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(1): 88-92.

Separation of Antioxidant Components from Meat Flavor and Their Antioxidant Capacities

WANG He-ya， YU Xi-yang， QIAN He*，YAO Wei-rong
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The antioxidant components in a commercial meat flavor prepared by Maillard reaction were separated by ultrafiltration and silica column chromatographic fractionation and their antioxidant capacities were investigated by measuring their inhibitory effects on the oxidation induced by AAPH or Fe3+/VC and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes. The meat flavor was fractionized into three fractions with molecular weights separately varying in three ranges. Among them, the high-molecular weight fraction had the strongest antioxidant activity, and it was further separated into three subfractions, H-MA, H-MB and H-MC and their order of polarity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC and their order of antioxidant activity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC. As a conclusion, the major component in the meat flavor responsible for antioxidant activity is the high-molecular weight fraction and the weaker polarity, the stronger antioxidant activity.

meat flavor；antioxidant；Maillard reaction products (MRPs)；liposome (LPS)

TS202.3

A

1002-6630(2010)19-0059-04

2010-01-14

汪何雅(1980—)，女，講師，博士，研究方向為營養與食品安全。E-mail：heyawang@163.com *通信作者：錢和(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：amtf168@126.com