黑靈芝多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及誘生細胞因子的影響

朱科學，聶少平，李文娟，余 強，張莘莘，謝明勇*

黑靈芝多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及誘生細胞因子的影響

朱科學，聶少平，李文娟，余 強，張莘莘，謝明勇*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室， 江西 南昌 330047)

目的：研究黑靈芝多糖(PSG-1)對小鼠脾淋巴細胞增殖及誘生細胞因子的影響。方法：采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測PSG-1在不同質量濃度、不同時間對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，檢測不同質量濃度PSG-1單獨作用及其與絲裂原共同作用對小鼠T、B淋巴細胞增殖作用的影響；用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法測定白介素-2 (IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結果：PSG-1在20～160μg/mL質量濃度范圍能顯著促進脾細胞的增殖，且48h效果最佳；PSG-1能顯著增強刀豆蛋白A (Con A)誘導的T淋巴細胞和脂多糖(LPS)誘導的B淋巴細胞的增殖作用；并且能顯著誘導脾淋巴細胞分泌IL-2和TNF-α。結論：PSG-1能有效的促進脾淋巴細胞的增殖，并與Con A、LPS對T、B淋巴細胞的增殖有協同刺激作用，還可以通過IL-2和TNF-α發揮免疫增強作用。

黑靈芝多糖；脾淋巴細胞；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法；酶聯免疫吸附實驗(ELISA)；白介素-2 (IL-2)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)

靈芝為多孔菌科真菌靈芝的子實體，在我國作為藥物已有2000多年的歷史。靈芝的有效成分非常豐富，目前已知的有多糖、麥角甾醇、三萜類、蛋白質、氨基酸、多肽等十大類，約150多種[1]。以往研究表明多糖是靈芝發揮生物活性的主要成分之一，其主要的藥理作用為增強免疫功能和抗腫瘤[2]。脾臟是人體最大的免疫器官，是T、B淋巴細胞聚集的部位[3]，而T、B淋巴細胞是機體的免疫活性細胞，其激活、分化、增殖在免疫應答過程中起著重要的作用[4]。目前，國內外研究過的靈芝屬真菌僅有赤芝、紫芝、樹舌、薄蓋靈芝、南方靈芝5種，其中赤芝研究最多，紫芝次之[5]，但有關黑靈芝多糖對小鼠脾淋巴細胞的免疫調節作用的研究國內外鮮見報道。因此，本實驗以江西贛南出產的黑靈芝為研究對象，研究黑靈芝多糖(PSG-1)對正常小鼠脾淋巴細胞增殖和誘生細胞因子的影響，初步研究PSG-1的免疫調節作用，旨在為黑靈芝的深入開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑靈芝多糖[6]本實驗室制備。

BALB/c純系小鼠，體質量25～30g，購自南昌大學醫學院實驗動物科。

胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、刀豆蛋白A (Con A) 、脂多糖(LPS) 美國Sigma公司；小鼠IL-2和TNF-α ELISA檢測試劑盒 南京建成科技有限公司；其余化學試劑均為分析純。

二氧化碳培養箱 日本Toshiba公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；TGL216G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水浴箱 上海精宏實驗設備有限公司；680型自動酶標讀數儀 美國Thermo公司；高壓滅菌裝備 上海醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備

參照文獻[7-9]，頸椎脫臼處死小鼠，用碘伏浸泡5min，再用75%乙醇浸泡小鼠3min，沿腹腔中線剪開小鼠腹腔，取出脾臟置于培養皿中，剪去脂肪和筋膜組織，用RPMI-1640培養液漂洗。置組織于研磨器中加入適量PBS液研磨，制成脾細胞懸液，過200目篩網，將得到的細胞懸液置于離心管中，1500r/min離心15min。棄上層清液，加入Tris-NH4Cl溶液9倍體積0.83g/100mL的NH4Cl溶液與1倍體積2.06g/100mL的Tris-HCl溶液(pH7.65)混合，用NH4Cl調節pH值至7.2)裂解紅細胞，室溫靜置5min，以除去紅細胞，見離心后所得為白色沉淀上方只有一層紅色膜為最佳狀態，用RPMI-1640培養液1000r/min離心10 min洗滌細胞3次，以除去剩余的氯化銨。將上述收集到的脾細胞置于培養瓶中，在37℃、5% CO2培養箱培養2h，以除去貼壁細胞，收集未貼壁的細胞懸液即為脾淋巴細胞。計數接種培養。臺盼藍染色計數，活細胞數大于95%。

1.2.2 PSG-1對小鼠脾淋巴細胞增殖的作用最佳濃度及最佳時間的考察

取小鼠脾淋巴細胞，調整細胞密度為5×106個/mL。 PSG-1實驗組：96孔細胞培養板中加入195.5μL/孔脾淋巴細胞懸液，再各加入2.5μL不同質量濃度的PSG-1，最后各加2μL的RPMI-1640培養液使 PSG-1的最終質量濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320μg/mL。每一濃度4個復孔，同時設置3個平行實驗，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養24、48、72h后每孔加MTT 20μL(5g/L)繼續孵育4h，棄去上清，然后每孔加入150μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，變色后用酶聯免疫檢測儀分別測定570nm波長處的吸光度A570nm，作為脾淋巴細胞增殖的指標[10]。

1.2.3 PSG-1對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響

同1.2.1節方法制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/mL，檢測PSG-1對小鼠T、B淋巴細胞的增殖作用。PSG-1對Con A誘導T淋巴細胞的增殖作用，PSG-1+Con A組：96孔細胞培養板中加入195.5μL/孔脾淋巴細胞懸液，再每孔加入2.5μL不同質量濃度的PSG-1，最后各加2μL含Con A的RPMI-1640培養液(含Con A終質量濃度為10μg/mL)；PSG-1對LPS誘導B淋巴細胞的增殖作用，PSG-1+LPS組：96孔細胞培養板中加入195.5μL/孔脾淋巴細胞懸液，再每孔加入2.5μL不同質量濃度的PSG-1，最后各加2μL含LPS的RPMI-1640培養液(含LPS終質量濃度為100μg/mL)。每一質量濃度4個復孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養 48h后每孔加MTT 20μL(5g/L)繼續孵育4h，棄去上清，然后每孔加入150μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，變色后用酶聯免疫檢測儀分別測定570nm波長處的吸光度A570nm。

1.2.4 IL-2、TNF-α的誘生

同1.2.1節方法制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/mL，加入到96孔培養板中，設對照組及PSG-1組(PSG-1的終質量濃度為25、50、100μg/mL)，每一質量濃度4個復孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養48h，收集上清液測定細胞因子含量。

1.2.5 細胞上清液中IL-2和TNF-α含量的測定

嚴格按試劑盒說明書進行實驗操作流程，建立標準曲線，通過繪制標準曲線求出上清液中IL-2和TNF-α的濃度。

1.2.6 統計學分析

組間差異采用統計軟件SPSS Statistics 17.0 作單因素ANOVA處理，數據統計以表示，以P＜0.05時，組間差異判斷為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PSG-1對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

圖1 PSG-1不同質量濃度、不同時間對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effect of PSG-1 with different concentrations on spleen lymphocyte proliferation at various times

由圖1可以看出，PSG-1在終質量濃度5～320μg/mL范圍內可促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，并且呈現量效關系，其中在20～160μg/mL范圍內促進效果顯著。同時，對PSG-1不同作用時間分析表明，在PSG-1刺激24、48、72h后，小鼠脾淋巴細胞均可顯著增殖，其中作用48h增殖幅度大，表明PSG-1作用48h對淋巴細胞的增殖效果顯著。

2.2 不同質量濃度PSG-1和絲裂原共同作用對脾淋巴細胞增殖作用的影響

圖2 PSG-1與Con A及LPS共同作用48h對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig.2 Effect of PSG-1 with Con A or LPS on the proliferation of spleen lymphocyte during 48 h period

由圖2可知，PSG-1在5～320μg/mL范圍內對Con A誘導的T淋巴細胞及LPS誘導的B淋巴細胞增殖均有協同作用，且在20～160μg/mL范圍內協同作用更為顯著。表明PSG-1對Con A誘導的T淋巴細胞及LPS誘導的B淋巴細胞的增殖有協同刺激作用。

2.3 PSG-1對小鼠脾淋巴細胞體外誘生IL-2和TNF-α的影響

在上述確定的PSG-1最佳作用質量濃度范圍內，選定25、50、100μg/mL三個劑量以檢測PSG-1對小鼠脾淋巴細胞體外誘生IL-2和TNF-α的影響，測定結果見圖3。結果表明：培養液中添加PSG-1能顯著增強小鼠脾淋巴細胞IL-2和TNF-α的分泌，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并隨著PSG-1質量濃度的增加，IL-2和TNF-α的分泌量也增加，存在著明顯的量效關系。

圖3 PSG-1對小鼠脾淋巴細胞體外誘生IL-2含量和TNF-α含量的影響Fig.3 Effect of PSG-1 on IL-2 and TNF-α induction of spleen lymphocyte in vitro

3 討 論

脾臟淋巴細胞中含有T淋巴細胞和B淋巴細胞，它們均是機體的免疫活性細胞，其增殖是反映細胞免疫最直接的指標[11]。本實驗研究發現，PSG-1對小鼠淋巴細胞的促增殖作用顯著，并存在明顯的量效關系。同時，本實驗成功地建立了小鼠脾淋巴細胞Con A和LPS誘導模型，Con A作為T淋巴細胞有絲分裂原，主要促進T淋巴細胞的增殖，LPS主要促進B淋巴細胞的增殖[12]。本研究表明，PSG-1與Con A、LPS共同作用均對小鼠T、B淋巴細胞增殖反應具有明顯的促進作用，由此推斷PSG-1可能是淋巴細胞的致有絲分裂原，通過促進淋巴細胞增殖，達到增強機體免疫能力的目的，對增強機體的免疫功能具有重要的意義。

細胞因子是一類由活化的免疫細胞(淋巴細胞、單核巨噬細胞等)和相關細胞(纖維細胞、內皮細胞等)產生的具有調節細胞功能的高活性、多功能蛋白質多肽分子或糖蛋白[13]，是免疫系統重要的信息分子，在免疫調節中充當十分重要的角色[14]，如IL-2和TNF-α是機體免疫調節中重要的調節因子。

1986年，Mosmann等[15]根據輔助T細胞活化后分泌細胞因子的不同將其分為Th1和Th2細胞。IL-2主要是由活化的Th1細胞或CD4+T細胞產生的一種有效的T淋巴細胞生長因子，在調節機體免疫功能、抗腫瘤方面有非常重要的作用；同時也是調節Th細胞亞型Th1和Th2細胞功能的關鍵因素之一[16]。IL-2的分泌能促使Th0細胞轉化為Th1細胞[17]，并促進Th1細胞自身的增殖和分化[16]；同時IL-2與T細胞、B細胞、單核細胞表面的IL-2受體結合后，能引起T細胞分化、增殖，促進細胞毒T細胞的殺傷作用，增強NK細胞活性[18]；其分泌水平高低可以反映機體的免疫功能，特別是細胞免疫功能[19]，在機體免疫應答過程中起關鍵作用[20]。本實驗研究了不同質量濃度PSG-1對小鼠脾淋巴細胞體外誘生IL-2的影響，結果表明，PSG-1可顯著促進脾淋巴細胞IL-2的分泌，且具有明顯的劑量依賴關系。由此推斷PSG-1能夠促進Th1細胞的增殖與分化，進而對Th1細胞介導的細胞免疫功能起促進作用。

TNF-α由巨噬細胞和淋巴細胞分泌，是一種重要的免疫調節因子；不僅能夠直接的抑制或殺傷腫瘤細胞，而且能激活巨噬細胞和中性粒細胞功能以及促進抗原活化T、B淋巴細胞增殖、分化等作用，促進單核巨噬細胞及其他細胞產生細胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身，發揮重要的免疫調節作用[21]。本研究在25、50、100μg/mL PSG-1作用下培養正常小鼠脾淋巴細胞48h后測定上清中TNF-α的含量，研究發現，PSG-1能劑量依賴性地增加脾淋巴細胞TNF-α的分泌，表明PSG-1可以通過促進細胞因子的分泌而增強機體的免疫功能，這也可能是其抗腫瘤的途徑之一。

綜上所述，PSG-1能有效的促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，并與Con A、LPS對T、B淋巴細胞的增殖有協同刺激作用，還可以通過促進IL-2和TNF-α的分泌發揮免疫增強作用。表明PSG-1可能是通過促進脾淋巴細胞增殖和誘導脾淋巴細胞IL-2和TNF-α分泌量的增加而達到增強機體的免疫功能。

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Effect of Polysaccharides from Ganoderma atrum on Spleen Lymphocyte Proliferation and Induction of Cytokine in Mice

ZHU Ke-xue，NIE Shao-ping，LI Wen-juan，YU Qiang，ZHANG Shen-shen，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To investigate the effect of polysaccharides from Ganoderma atrum (PSG-1) on spleen lymphocyte proliferation and induction of cytokine in mice. Methods: The effects of treatments with PSG-1 and with PSG-1 containing motigen at different concentrations on spleen lymphocyte proliferation were determined by MTT. The contents of IL-2 and TNF-α were determined by using ELISA. Results: PSG-1 at a concentration ranging from 20 to160 μg/mL resulted in a significant increase of lymphocyte proliferation, and 48 h administration gave the best proliferation. PSG-1 could also enhance the effect of Con A-induced T lymphocyte proliferation and the stimulation index of LPS-induced B lymphocytes. Moreover, PSG-1 could significantly increase the secretion of IL-2 and TNF-α in spleen lymphocyte. Conclusion: PSG-1 can effectively increase lymphocyte proliferation and enhance the effect of Con A, LPS-induced T and B cell growth. PSG-1 has the ability to enhance immune responses by increasing the secretion of IL-2 and TNF-α.

Ganoderma atrum polysaccharides；spleen lymphocyte；MTT；ELISA；IL-2；TNF-α

Q946.3；Q952.6

A

1002-6630(2010)19-0351-04

2010-06-23

國家“863”計劃項目(2008AA10Z325)；食品科學與技術國家重點實驗室目標導向資助項目(SKLF-MB-200806)；江西省科技廳科技攻關重點項目

朱科學(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品科學研究。E-mail：zhukexue163@163.com

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品化學、食品營養與安全研究。E-mail：myxie@ncu.edu.cn