深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達(dá)

王淑軍，呂明生，李華鐘，徐金利,，焦豫良，房耀維，劉 姝

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達(dá)

王淑軍1，呂明生1，李華鐘2，徐金利1,2，焦豫良1，房耀維1，劉 姝1

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

根據(jù)NCBI上公布的普魯蘭酶基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，以Thermococcus siculi HJ21基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到T. siculi HJ21普魯蘭酶的基因，測序后通過Blast(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對和分析表明擴(kuò)增基因有一個4056bp、編碼1351個氨基酸的開放閱讀框，為一新的普魯蘭酶基因。將該基因插入表達(dá)載體pET28a，并轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，測定普魯蘭酶比活力。重組轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞破碎液有高溫普魯蘭酶活性，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示出分子質(zhì)量約為150kD的特異性條帶。

Thermococcus siculi HJ21；普魯蘭酶；基因；PCR

普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41) 是一種能夠?qū)Ｒ恍运馄蒸斕m多糖和其他多糖如淀粉、糖原和極限糊精中的α-1,6糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫支酶[1-2]。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途，可大規(guī)模地提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率[3-4]。普魯蘭酶可以單獨(dú)使用，亦可與其他酶配合使用，相輔相成收到良好的效果[5-7]。該酶已被較成熟地應(yīng)用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)中[8-9]。目前我國對于該酶的研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，因此無此酶的生產(chǎn)技術(shù)，普魯蘭酶制品主要依賴進(jìn)口[10]。

來自嗜熱菌Thermococcus siculi HJ21的耐高溫普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度為95℃，且溫度的穩(wěn)定性較好，因而具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆T. siculi HJ21的普魯蘭酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以為該酶的工業(yè)應(yīng)用提供參考。……