木香倍半萜對血管內皮細胞生長因子的抑制作用

郝立杰,趙 烽,高治廷,許 卉,劉 珂

1煙臺大學藥學院,煙臺 264005;2煙臺賽爾斯生物技術有限公司,煙臺 264006

木香倍半萜對血管內皮細胞生長因子的抑制作用

郝立杰1,2,趙 烽1＊,高治廷1,許 卉1,劉 珂1

1煙臺大學藥學院,煙臺 264005;2煙臺賽爾斯生物技術有限公司,煙臺 264006

對 EL ISA法測定人血管內皮細胞生長因子(human VEGF)的檢測條件進行研究,考察了酶標板種類、一抗包被時間、紫外輻照等對酶聯免疫反應的影響,優化了檢測條件:可采用廣州潔特公司生產的酶標板替代進口 Costar酶標板,一抗包被時間 24 h,一抗包被前紫外輻照 30 min可明顯提高酶標板對包被抗體的親和力。利用優化的檢測條件測定了木香揮發油、土木香揮發油、木香主要單體成分脫氫木香內酯 (dehydrocostus lactone, 1)和木香烯內酯(costunolide,2)對人肺腺癌A549細胞分泌VEGF的抑制作用,同時以MTT法測定藥物對A549腫瘤細胞生長的抑制作用。結果表明,木香揮發油、土木香揮發油、脫氫木香內酯和木香烯內酯在不影響細胞增殖的濃度范圍內,可明顯抑制A549細胞分泌VEGF。

VEGF;木香;土木香;脫氫木香內酯;木香烯內酯

血管生成對腫瘤的生長和轉移具有重要作用[1]。新生血管的生長和成熟是一個復雜的多因子和多信號傳導過程的結果,其中涉及到很多血管生成因子如血管內皮細胞生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素 (angiopoietin)等,以及抑制血管生成的因子如內皮細胞抑制素 (endostatin)、腫瘤抑素 (tumstatin)、可溶性血管內皮細胞生長因子受體 (s VEGFR)等。一般情況下這兩類因子處于平衡狀態。腫瘤發生時能促進血管生成因子分泌,其中最主要的是 VEGF。大量研究結果表明VEGF在許多癌癥組織中過量表達,包括肝癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等。VEGF及其受體 (vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)在腫瘤的生長和轉移中起關鍵性作用,所以可以通過阻斷或干擾VEGF/VEGFR信號傳導通路來控制腫瘤生長。近年來以VEGF及其受體作為靶分子的抗腫瘤新藥研發取得了很大的進展,已經有數個藥物經美國 FDA批準上市。本文以 VEGF的酶聯免疫(EL ISA)檢測條件優化為基礎,研究木香揮發油及主要倍半萜單體化合物的抗腫瘤作用是否與抑制VEGF有關。

木香為菊科多年生草本植物木香Saussurea lappaDecne.的干燥根,別名:云木香、廣木香。原產印度,主要分布于我國陜西、甘肅、湖北、湖南、四川、云南、西藏等地,以四川、云南西北部種植較多,產量較大。商品木香目前主要分為三類,即木香、川木香及土木香,其中土木香主要作為木香的代用品使用。傳統醫學認為,木香具有行氣止痛之功效,多用于胃腸氣滯所致的脘腹脹痛、嘔逆少食或用于濕熱痢疾而腹痛,里急后重?，F代藥理學研究表明:木香還具有改善胃潰瘍[2,3]、收縮、炎癥[4,5]、肌梗塞及心絞痛[6]等作用,臨床上常用于潰瘍病、膽絞痛、支氣管哮喘等疾病的治療[7]。木香所含的主要有效成分存在于揮發油中,是以脫氫木香內酯 (dehydrocostus lactone,1)和木香烯內酯 (costunolide,2)為主的多種倍半萜類化合物的混合物。Lee等[8]首次對木香烯內酯的抗腫瘤作用進行了探討,證明木香烯內酯可通過釋放細胞色素 C誘導腫瘤細胞凋亡。作者前期對木香和土木香進行了化學成分研究,通過提取分離結合化學修飾等手段共獲得 18種木香倍半萜單體化合物并研究了其體外抗腫瘤活性,結果表明木香揮發油、土木香揮發油、脫氫木香內酯、木香烯內酯對人肺癌A549細胞增殖均表現較好的抑制活性[9],本文擬在對 VEGF酶聯免疫檢測條件進行優化的基礎上,研究以上活性部位及活性單體的抗腫瘤活性是否與VEGF相關。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國 Costar及廣州潔特 (JET)生物過濾制品有限公司生產的 96孔可拆分高親和力聚苯乙烯酶標板;CKX31型倒置顯微鏡 (菲律賓奧林巴斯公司);恒溫 CO2培養箱 (美國 Thermo公司);5810 R型臺式高速低溫離心機 (德國 Eppendorf公司);全自動酶標儀 (美國Biotek集團)。

木香揮發油、土木香揮發油、脫氫木香內酯和木香烯內酯(化學結構式見圖 1)以細胞培養級DMSO溶解,并稀釋至所需濃度,-20℃冰箱保存備用。人血管內皮生長因子單克隆抗體 (MAB293)、生物素化抗體 (BAF293)、重組人 VEGF 165(293-ve)、Streptavidin-HRP (DY998)、 Substrate Reagent (DY999)購自 R&D公司;RP M I 1640培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自 Invitrogen公司;胰酶、MTT、DMSO購自Amresco公司,其余試劑均為國產分析純。

圖 1 脫氫木香內酯和木香烯內酯的化學結構式Fig.1 Chemical structures of dehydrocostus lactone and costunolide

1.2 緩沖液配制

包被液:PBS(磷酸鹽緩沖液);封閉液:1% BSA,5%蔗糖,0.05%疊氮鈉/PBS;洗滌液:0.05% Tween-20/PBS;酶結合物稀釋液:1%BSA/PBS;顯色劑:R&D公司 Substrate Reagent(DY999);終止液:1 mol/L硫酸

1.3 細胞培養

人肺腺癌細胞A549為煙臺大學分子藥理實驗室保種。用含 10%胎牛血清的 RPM I 1640培養液(含青霉素 1×105U/L,鏈霉素 100 mg/L),于 37℃CO2培養箱中常規培養,隔天傳代。A549細胞呈貼壁狀態生長。

1.4 MTT法測定細胞活性

將細胞密度為 1×105個/mL的單細胞懸液接種于 96孔細胞培養板內,每孔 200μL,于 CO2培養箱中常規培養。24 h后分別加入不同濃度的待測試樣品,每個濃度設3個平行孔,同時設DMSO空白孔,培養 48 h后,每孔加入MTT 8μL(終濃度為 200 μg/mL),繼續培養 4 h后棄去上清,吸干殘留液,每孔加入DMSO 100μL,振搖至生成的藍紫色結晶完全溶解后,以 630 nm為參比波長,用酶標儀測定570 nm處的吸光值 (A570)。細胞增殖抑制率 (%) =100×(1-實驗組 A570/空白對照組 A570)。

1.5 測定蛋白濃度

以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液繪制工作曲線,利用 Bradford法測定細胞培養上清液總蛋白濃度。

1.6 EL ISA檢測條件的優化研究

1.6.1 聚苯乙烯酶標板的選擇

分別采用 Costar及 JET的 96孔可拆分高親和力聚苯乙烯酶標板作為固相載體,進行 EL ISA檢測并比較結果。

1.6.2 聚苯乙烯酶標板經紫外線輻照處理

聚苯乙烯酶標板置于裝有紫外燈 (S W-CJ-1Cu型,蘇州凈化設備有限公司)的醫用凈化工作臺上,固定紫外燈與酶標板基底的垂直距離為 10 cm,于空氣中對酶標板作 30 min輻照處理,完畢后置室溫儲存備用。

1.6.3 抗體包被時間的改變

用 PBS磷酸鹽緩沖液將 hVEGF單克隆抗體稀釋至 1μg/mL后,將其置于 4℃中分別包被 24、48、72 h,封閉洗滌甩干后備用。

1.6.4 EL ISA檢測方法

經包被、封閉、加樣、溫育等過程,拍干后加生物素化抗 hVEGF抗體 100μL/孔,37℃溫育 60 min,洗板 4次,拍干后加入HRP酶結合物 100μL/孔,37℃溫育 30 min,洗板 4次,徹底拍干后加入 T MB顯色劑 100μL/孔,37℃溫育 30 min,然后加入終止液50μL終止反應,酶標儀 450 nm處測量吸光值。

1.7 數據統計學處理

2 結果

2.1 EL ISA檢測條件的優化研究

2.1.1 聚苯乙烯酶標板的選擇

分別取 Costar及 JET公司生產的酶標板條,加入抗 hVEGF單克隆抗體在 4℃下包被 24 h,進行EL ISA測定。如圖 2所示,Costar及 JET酶標板條對抗 hVEGF單克隆抗體的親和力無明顯差別,由于JET酶標板價格低于 Costar酶標板,因此以后的實驗中均選擇 JET酶標板以節約實驗成本。

圖 2 不同廠家酶標板的比較Fig.2 Comparison of EL ISA plates from differentmakers

2.1.2 紫外輻照的影響

如圖 3所示,經紫外輻照后 JET酶標板所測得吸光值較輻照前明顯提高,表示紫外輻照可提高JET酶標板條對抗 hVEGF單克隆抗體的親和力。

圖 3 紫外輻射對 JET酶標板吸光值的影響Fig.3 Effect ofUV on the absorbency of JET plate

2.1.3 包被時間的影響

如圖 4所示,一抗包被 24 h即可達到較理想的效果,延長包被時間至 48 h或 72 h吸光值反而有所降低,因此將一抗包被時間確定為 24 h。

圖 4 不同包被時間對吸光值的影響Fig.4 Effect of coating time on the absorbency

2.2 木香揮發油、土木香揮發油及倍半萜單體對VEGF的抑制作用

2.2.1 對A549細胞增殖的影響

按照 1.4節所述MTT方法檢測藥物對A549細胞增殖的影響,計算細胞增殖抑制率。如表 1所示,木香揮發油在 0.20～3.12μg/mL,土木香揮發油在0.20～12.5μg/mL,脫氫木香內酯和木香烯內酯在0.20～25μg/mL濃度范圍內對A549細胞增殖無明顯抑制作用。

表 1 藥物對A549細胞增殖的影響Table 1 Effects of test drugs on the cell proliferation ofA549

3.12 2.2 10.1 6.5 -7.5 1.56 0.1 -7.2 4.6 -3.6 0.78 2.9 0.2 2.2 0.3 0.39 0.3 1.3 0.3 2.5 0.20 4.3 0.6 1.5 6.1

2.2.2 對A549細胞分泌VEGF的抑制作用

在藥物對細胞增殖無明顯抑制作用的濃度范圍內,以優化后的 EL ISA檢測條件測定 VEGF濃度。取 JET酶標板進行紫外輻照 30 min后,每孔加入100μL抗人VEGF單克隆抗體,將其置于 4℃中包被 24 h后,封閉洗滌甩干后,加入樣本按照 1.6.4所述方法進行測定,吸光度值和VEGF濃度的標準曲線如圖 5所示,根據該標準曲線計算細胞培養上清液樣本中VEGF的濃度。

另外以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液繪制工作曲線 (圖 6),利用 Bradford法測定細胞培養上清液樣本中的總蛋白濃度。

圖 5 VEGF濃度和吸光值的標準曲線Fig.5 Working line of the VEGF concentration and absorbance

圖 6 BSA蛋白濃度和吸光值的標準曲線Fig.6 Working line of the BS A concentration and absorbance

最后,按照以下公式計算樣本單位蛋白中所含的VEGF濃度:單位蛋白中所含的VEGF濃度 (pg/ mg)=VEGF濃度(pg/mL)/總蛋白濃度(mg/mL),實驗結果見表 2,組間比較采用 t檢驗。

表 2 藥物對A549細胞分泌VEGF的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of test drugs on the release ofVEGF in A549 cells

3 討論

本實驗在測定細胞培養上清液中VEGF濃度的同時,利用Bradford法測定總蛋白含量,計算單位蛋白中VEGF的含量,可校正由于細胞分布不均或細胞死亡導致的測定誤差。實驗結果表明,木香揮發油和土木香揮發油均可明顯抑制 A549細胞分泌VEGF,作用強度相當,可為使用土木香作為木香的臨床替代品提供一定的理論依據。脫氫木香內酯和木香烯內酯為木香和土木香藥材中的主要化學成分,實驗結果表明這兩種倍半萜類化合物可明顯抑制A549細胞分泌VEGF,提示VEGF可能為木香及其制劑發揮抗腫瘤作用的主要作用靶點之一,木香及其有效成分對于VEGF蛋白表達及基因水平的影響正在進一步研究中。

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Inhibitory Effects of Sesquiterpenes fromSaussurea lappa on the Vascular Endothelial Growth Factor

HAO Li-jie1,2,ZHAO Feng1＊,GAO Zhi-ting1,XU Hui1,L IU Ke1

1School of Phar m acy,YantaiUniversity,Yantai 264005,China;2Yantai Science&B iotechnology Co.,Ltd.,Yantai 264006,China

In this paper,the EL ISA method to detect human VEGF was studied and optimized.The effectof EL ISA plate materials,coating time of the capture antibody,ultraviolet irradiation were studied,and the optimized detection condition is following:Jet EL ISA plate can be used instead of costar EL ISA plate;24 h is the best for the capture antibody coating time;ultraviolet irradiation increases the reaction to the capture antibody.Petroleum ether fractions ofSaussurea lappaandInula helenium,two main constituents dehydrocostus lactone(1)and costunolide(2)were evaluated for their inhibitory activities on the VEGF realease in human lung cancer cell line A549.The effects of above test samples on the cell proliferation ofA549 were evaluated byMTTmethod.The results indicated that the petroleum ether fractions of S. lappa andI.helenium,dehydrocostus lactone and costunolide significantly inhibited theVEGF release,wherereas the cell proliferation ofA549 cellswas not affected.

VEGF;Saussurea lappa;Inula helenium;dehydrocostus lactone;costunolide

R969.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0687-05

2009-05-27 接受日期:2009-09-22

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金 (2006BS02005, 2007BS02005)

＊通訊作者 Tel:86-535-6706921;E-mail:zhaofeng74@yahoo.com.cn