香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

陳 琳,許高云,饒小珍,陳寅山

福建師范大學生命科學學院,福建閩侯 350108

香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

陳 琳,許高云,饒小珍,陳寅山＊

福建師范大學生命科學學院,福建閩侯 350108

研究香螺 (Naptunea cum ingicrosse)肌肉、血清和唾液腺凝集素對 7種脊椎動物紅細胞、人的 4種紅細胞、4種單細胞藻類和 11種微生物細胞的凝集性能,同時進行 pH敏感性、熱穩(wěn)定性、糖抑制性、EDTA、金屬離子以及鹽濃度影響試驗。結果表明,3種凝集素對各種細胞的凝集效應存在差異,以家兔紅細胞的凝集效果最佳。肌肉和血清凝集素在 pH＜7.0時均失活,唾液腺凝集素的熱穩(wěn)定性最強,溫度為 90℃仍具有活性。此外,不同的糖溶液對3種凝集素凝集效果的影響不同,在 EDTA濃度為2.00～0.25 mmol/L范圍內,3種凝集素的凝集效價均受到不同程度的抑制。在金屬離子影響試驗中發(fā)現,Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素的凝集活力,而對唾液腺凝集素有抑制的作用。當鹽濃度為 12～18 g/L時,可增加香螺肌肉凝集素的凝集效價,而當濃度為 24～60 g/L時卻會抑制肌肉凝集素的凝集活性。

香螺;凝集素;凝集活力;性質

凝集素是一類具有糖結合專一性的糖蛋白或蛋白質,其不僅能夠區(qū)分不同的單糖,同時能夠特異性連接不同低聚糖,檢測糖復合物結構的細微不同[1],這使它們成為生物化學、細胞生物學、免疫學及醫(yī)學領域研究的有用工具[2]。凝集素廣泛存在于生物體中,目前在動物、植物、微生物中均有發(fā)現,其中以植物凝集素的研究最早、最多,近年來由于發(fā)現凝集素在無脊椎動物中具有重要的作用[3],無脊椎動物凝集素逐漸成為研究的熱點。

香螺 (N.cum ingicrosse)是屬于腹足綱 (Gastropoda),前鰓亞綱 (Prosobranchia),狹舌目 (Stenoglossa),蛾螺科 (Buccinidae)的溫帶海水螺類,是我國沿海重要的海產螺類,個體大,足部肌肉肥大,有較大的經濟價值,其凝集素研究至今未見報道。本文從香螺血清、足部肌肉、唾液腺中提取凝集素,研究其對 7種脊椎動物紅細胞、人的 4種紅細胞、4種單細胞藻類和 11種微生物細胞的凝集性能,同時進行pH敏感性、熱穩(wěn)定性、糖抑制、EDTA、金屬離子以及鹽濃度影響試驗,為尋找凝集素來源及探討凝集反應發(fā)生的復雜生理機制提供基礎資料,也為進一步的分離純化凝集素、開發(fā)凝集素的新來源提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

香螺購自福州市西營里農貿市場。家兔 (O ryctolagus cuniculus)由福建醫(yī)科大學實驗動物房提供,家雞(Gallus gallus),半番鴨(Carina m oschata),家鴿(Colum ba livia dom estica),鵪鶉(Coturnix coturnix),白鰱(Hypophtha lm ichthys m olitrix)等 5種動物血樣取自福州市閩侯上街農貿市場,小鼠(M us m usculus)由福建師范大學發(fā)育生物學實驗室提供,人的A型、B型、AB型、O型等 4種血樣的全血由福州市第二醫(yī)院提供。各種單細胞藻類由福建師范大學藻類學實驗室提供,微生物菌種由本實驗室提供。

1.2 凝集素的制備

將香螺洗凈,用濾紙吸干其表面水分,砸開螺殼,收集其血液以 8000 r/min,4℃離心 20 min,離心后取上清液,為血清凝集素,4℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗夥謩e取下肌肉、唾液腺,組織搗碎機充分搗碎后放入燒杯,按 1:1(v/v)加入 PBS緩沖液,攪拌后用保鮮膜封口,4℃靜置過夜。第二天取出分別以 10000 r/ min,和 15000 r/min 4℃離心 20 min,然后分別取上清液即為肌肉凝集素和唾液腺凝集素,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定 3種凝集素的蛋白質含量,以結晶牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白。

1.4 凝集實驗

1.4.1 動物和人血細胞凝集實驗

動物血樣(用 3.8%檸檬酸鈉抗凝)以及人的A型、B型、AB型、O型等4種血樣的全血經1500 r/ min離心 5 min除去血漿,用生理鹽水離心洗滌 3次,再用生理鹽水配制成體積分數為 2%的細胞懸浮液,供實驗用。

凝集反應在 96孔V型微量血凝板中進行。先在每孔中加入 25μL生理鹽水,再往第一孔中加入25μL凝集素,混勻后,從第一孔中吸取 25μL加入第二孔中,以此類推做倍比稀釋,最后在每孔中分別加入 25μL 2%紅細胞懸浮液,以 25μL的生理鹽水作對照,均勻搖動 1 min,在室溫下靜置 2 h,肉眼或顯微鏡下觀察實驗結果。

1.4.2 單細胞藻類的凝集實驗

海產小球藻 (Chlorella vulgaris)、心形扁藻(Platym onas cordifor m is)、云微藻(Chlorella sp.)、金藻(Porphyridium purpureum)用無菌海水離心洗滌 2次再稀釋配成藻類細胞懸液,最終濃度為 8.0×106個∕mL。凝集實驗在雙凹片上進行,先取 40μL樣品,然后再加入等量的單細胞藻懸液,混勻 2 h后鏡檢結果。用等量的無菌海水代替樣品溶液作為對照。

1.4.3 細菌和真菌的凝集實驗

大腸桿菌 (Escherichia coli.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、甘薯薯瘟病原細菌(Fasarium axyssporam)、綠膿桿菌(Pseudom onas eruginosa)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化,以 0.85%無菌生理鹽水配成終濃度為108個 /mL的菌懸液。青霉 (Penicilliumchrysogenum.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus stolonoifer.)、玉米大斑病菌(Helm inthos porium)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)則用孟加拉紅培養(yǎng)基活化,再以無菌生理鹽水配成 108個/mL的孢子懸液。凝集實驗在雙凹片上進行,方法同上,針對不同的菌種,分別用等量的無菌生理鹽水代替樣品溶液作為對照。

1.5 理化性質實驗

1.5.1 溫度和 pH敏感性實驗

3種凝集素各用 EP管分裝 7管,再分別放入30、40、50、60、70、80、90℃恒溫水浴鍋中 15 min,在V型微量血凝板中進行倍比稀釋,用家兔紅細胞懸浮液檢測其凝集活性的變化情況,以不做任何處理的樣品做對照。

把各凝集素 pH調至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,4℃放置 2 h后,再將各溶液的pH調回7.2,然后在V型微量血凝板中測定各樣品的凝集活力。需以未處理過的樣品做對照。

1.5.2 糖抑制實驗

將D-葡萄糖(D-glucose)、蔗糖(Sucrose)、D-半乳糖 (D-galactose)、D-乳糖 (D-lactose)、D-甘露糖(D-m annose)、D-樹膠醛糖 (D-A rabinose)、木糖(Xy-lose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(M altose)等 9種糖配成濃度均為 0.2 mol/L的糖溶液。在V型微量血凝板中將 3種凝集素進行倍比稀釋后,向每孔中各加入 25μL的糖溶液,均勻搖動 1 min,靜置 1 h后再加入25μL的家兔紅細胞懸浮液,2 h后觀察實驗結果。用生理鹽水代替糖溶液作空白對照。

1.5.3 EDTA、金屬離子和鹽度的影響實驗

用 EDTA的鈉鹽配置濃度分別為 2.00、1.00、0.50、0.25 mmol/L的 EDTA溶液,凝集實驗方法同糖抑制實驗,觀察不同濃度的 EDTA對凝集性能的影響。以生理鹽水代替 EDTA溶液作為空白對照組。

用 CaCl2、ZnCl2、MnCl2·4H2O和MgCl2·6H2O分別配成濃度為 0.01 mol/L的溶液,方法同上,觀察不同金屬離子對凝集性能的影響。用生理鹽水代替金屬溶液作空白對照。

將樣品用鹽度為 6、12、18、24、30、36、48(g/L)等不同濃度的鹽水進行倍稀釋后,檢測對兔紅細胞的凝集活性。以生理鹽水代替鹽溶液做對照實驗。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量

所提取的肌肉粗蛋白的濃度為 21.61 mg/mL,血清粗蛋白的濃度為 1.47 mg/mL,唾液腺粗蛋白的濃度為 4.68 mg/mL。

2.2 對動物和人血細胞的凝集作用

香螺肌肉、血清和唾液腺等 3種凝集素對11種血細胞的凝集結果見表 1,結果顯示,肌肉和血清凝集素對兔血的凝集活力最強,發(fā)生凝集所需的最低蛋白質濃度分別為 0.169 mg/mL和 0.735 mg/mL,肌肉凝集素對半番鴨、家鴿、鵪鶉的血細胞無凝集活性,對小鼠和人的 4種紅細胞發(fā)生凝集反應的所需的最低蛋白質濃度在 1.351～2.702 mg/mL之間。血清凝集素只對兔血和人的 A型血細胞有凝集活力,唾液腺凝集素對家雞、半番鴨、家鴿、鵪鶉亦無凝集活力。以后實驗中均以 2%兔血紅細胞作為指示細胞。

表 1 香螺 3種凝集素對 11種紅細胞的凝集活性Table 1 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse on 11 kinds of erythrocytes

2.3 對單細胞藻類和微生物的凝集作用

由表 2和表 3可知,3種凝集素對不同微生物的凝集效價不同,肌肉凝集素只對海產小球藻、金藻發(fā)生凝集,血清凝集素只對心形扁藻無凝集,唾液腺凝集素則對各種單細胞藻類和微生物細胞均無凝集作用。肌肉凝集素對綠膿桿菌無凝集作用,對根霉和稻瘟病病菌有凝集作用。血清凝集素對真菌也均無凝集作用。

2.4 pH和溫度對凝集活性的影響

表 2 香螺 3種凝集素對單細胞藻類的凝集作用Table 2 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN. cum ingicrosse on alga cells

實驗設置的 8個 pH(3.0～10.0)和 7個實驗溫度(30～90℃)對 3種凝集素凝集活性影響見表 4。結果顯示,香螺的肌肉和血清凝集素均不耐酸而耐堿,當 pH ＜7.0時均失活,而 pH ＞7.0時都具有活力,其中肌肉凝集素在 pH=8.0時活性有明顯的提高,發(fā)生凝集的最低蛋白質濃度只需 0.006 mg/mL。唾液腺凝集素表現出很強的酸堿耐受性,pH 3.0～ 9.0范圍內都具有活性。溫度方面,當溫度在 50℃之后,肌肉凝集素開始沒有凝集活力,血清則在 40℃起就無凝集效果,而不同溫度處理后的唾液腺凝集素的凝集活性變化影響不大,其熱穩(wěn)定性最好。

表 3 香螺 3種凝集素凝集微生物細胞或孢子的活力Table 3 The agglutinating activities on the unicellularmicrobe of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

表 4 pH和溫度對香螺 3種凝集素凝集活性的影響Table 4 The effect of the pH and temperature on the agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

2.5 糖溶液對凝集活性的影響

表 5為 9種糖類對 3種凝集素凝集活力的影響結果。由表 5可知,供試的 9種糖中,只有 D-甘露糖能抑制肌肉凝集素的活性,而 D-甘露糖卻不能抑制血清和唾液腺凝集素的活性。各種糖溶液對血清凝集素的凝集作用均無抑制效果。此外,D-樹膠醛糖和D-乳糖可抑制唾液腺凝集素的凝集作用。

表 5 糖溶液對香螺 3種凝集素凝集活性的影響Table 5 The effect of the glycose solution on the agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

“+”表示有抑制用用;“-”表示無抑制作用。“+”is having agglutinating activities;"-”is no agglutinating activities.

2.6 金屬離子和鹽度對凝集活性的影響

EDTA對 3種凝集素凝集活力的影響見表 6。由表 6可知,經過不同濃度的 EDTA處理,3種凝集素的凝集活力受到不同程度的抑制,當 EDTA濃度為 2.00 mmol/L時,肌肉凝集素發(fā)生凝集所需的最低蛋白質濃度在 0.169～2.702 mg/mL之間,當 EDTA濃度的降低至 0.50 mmol/L時,發(fā)生凝集所需的最低蛋白質濃度升為 10.805 mg/mL,凝集活力降低。還可以看出血清和唾液腺凝集素也受到不同程度的抑制。

4種金屬離子對 3種凝集素凝集家兔紅細胞的影響實驗結果見表 6。由表 8可以看出,4種金屬離子中 Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素對家兔紅細胞的凝集活力,而對唾液腺凝集素反而有抑制的作用。而Mn2+、Mg2+和 Ca2+對 3種凝集素的凝集活性沒有明顯的影響。

表 6 EDTA及金屬離子對香螺 3種凝集素對家兔紅細胞凝集活性的影響Table 6 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse on different densities of EDTA and metal ions

鹽度對香螺的肌肉凝集素的凝集活性具有一定的影響,而對香螺血清和唾液腺凝集素的凝集效價影響不明顯,見表 7,當鹽度為 12 g/L時,肌肉凝集素發(fā)生凝集所需的最低蛋白質濃度為 0.042 mg/ mL,從鹽度為 24 g/L起就是起到抑制作用,同比之下,血清和唾液腺凝集素受鹽度的影響不大,血清凝集素的凝集作用所需的最低蛋白質濃度在 0.368～0.735 mg/mL間波動,而唾液腺凝集素則在 0.585～1.170 mg/mL之間。

阿拉伯數字表示樣品溶液產生凝集反應的最低蛋白質濃度(mg/mL);“-”表示無凝集反應。The arabic figures isminimum level of apolipoprotein on agglutinating activities(mg/mL);"-”is no agglutinating activities.

3 討論

3.1 細胞凝集作用是凝集素最重要的生物學功能之一,它是基于凝集素分子與細胞表面糖分子的專一性結合。早在 20世紀初,Landsteiner和 Raubitschek就證明了凝集素的血凝作用具有供血動物種屬專一性,同時還與血型有關。之后又發(fā)現,凝集素除了凝集紅細胞外,對某些微生物細胞、精子、骨髓細胞、胚胎來源的細胞甚至是癌細胞也具有凝集作用[4-7]。

本實驗分別從香螺的肌肉、血清和唾液腺中提取凝集素,這 3個不同來源的凝集素對 11種脊椎動物血細胞、4種單細胞藻類以及 11種微生物細胞的凝集性能存在著較大的差異,表明香螺體內含有不同的凝集素,這和許高云等[8]對蚶形無齒蚌凝集素的研究結果相似。實驗結果顯示 3種凝集素均對兔紅細胞的凝集活力較強,這和 Fabregas[9]、Ainouz[10]、陳寅山[11]等得出的結論一致。而同種凝集素對不同的紅細胞凝集程度呈現差異,這和薛江楠[12]、梁青龍[13]等研究的結果相似。這些差異主要與凝集素分子的大小、糖結合位點的數量和細胞分子表面的特性等有關[4]。當某種凝集素與某種紅細胞不發(fā)生凝集時,則說明該紅細胞表面不存在與這種凝集素專一性結合的糖分子。如本實驗中,3種凝集素均對半番鴨、家鴿和家雞的紅細胞不發(fā)生凝集作用。此外,本研究中,受試的微生物細胞對香螺的 3種凝集素的凝集反映敏感性較低,僅專一的對某些微生物具有凝集作用。這與 Bird等[14]早期研究藻類凝集素對細菌的凝集作用的結果相似。張嵐等[15]認為唾液凝集素主要通過識別細菌表面蛋白來介導細菌的凝集或黏附。3種凝集素對微生物的凝集活性的不同,除了凝集素本身的不同引起外,還可能與這些細胞表面結構和細胞外產物有關,同時還可能與這些微生物自身的運動習性和生活習性等有關,這還有待于進一步研究。本研究將為凝集素在不同類型細胞表面糖分子特征及細胞鑒別等方面的研究提供理論的依據,同時對弄清螺類病原微生物的致病機理提供幫助。

3.2 香螺的肌肉,血清和唾液腺 3種凝集素的 pH值的適應范圍存在著差異,肌肉和血清凝集素比較相近,在 pH 7.0～10.0上具有凝集活性,而唾液腺凝集素則具有更廣的適應范圍,pH 3.0～9.0均表現出凝集活性。這表明了,不同的凝集素保持凝集活性的 pH范圍不同,這與許多研究的結果相似,如三角帆蚌肌肉凝集素在 pH 6.0～8.0普遍表現出較強的凝集活性[16],九孔鮑血清凝集素的活性在 pH 6.0～12.0,凝集活性沒有變化[17],日本對蝦(Penaeus japonicus)的凝集素活性在 pH 5.0～7.5時穩(wěn)定,pH 8.0～9.0時迅速下降[18]。導致這些差異一方面可能是因為 pH的變化影響溶液中離子鍵的相互作用,從而影響凝集素表面的發(fā)生變化,導致凝集活性的改變,另一方面可能是因為當 pH處在與動物內環(huán)境相近的酸堿度時,表現出較強的凝集活性,這只是一種正常反應。此外受試細胞的代謝狀態(tài)和表面電荷也可能是影響凝集反應的一個原因[19]。

熱穩(wěn)定性方面,3種凝集素耐熱性不同,60℃開始肌肉凝集素開始沒有凝集活力,血清則在40℃起就已無凝集活性,而唾液腺凝集素表現出強的熱穩(wěn)定性,這可能是和凝集素分子中蛋白質和糖的含量不同有關[20]。受熱后的蛋白質結構改變進而失活,這可能是凝集素失活的最主要的原因,糖耐熱性好,含糖量高的凝集素其熱穩(wěn)定性就可能較好,由此可以推斷唾液腺凝集素的含糖量可能最高。另外,也可能和凝集素的活性位點有關,還可能和香螺的棲息環(huán)境溫度有關.[21]。

3.3 凝集素有選擇地對異物產生凝集反應,主要是由于凝集素帶有特異性的糖基決定簇的受體[22]。糖類特別是單糖,有時二糖、三糖或者多糖,能對凝集素的凝集反應起到抑制的作用[23],這在很多的研究中都得到了證實,如麗文蛤的血清凝集活性被 D-甘露糖、D-麥芽糖抑制[24];背角無齒蚌和三角帆蚌的血清凝集素可被多種單糖抑制[12]。但饒小珍[17]等對九孔鮑血清凝集素進行的糖抑制實驗卻發(fā)現10種糖溶液對凝集效果均沒有抑制作用。王新生[21]等發(fā)現褶紋冠蚌肌肉凝集素不能被受試的 7種糖所抑制。本實驗結果發(fā)現,只有 D-甘露糖抑制了香螺肌肉凝集素的凝集活性,其余的均無抑制作用。各種糖溶液對血清凝集素的凝集作用均無抑制效果。這可能是由于這 3種凝集素表面的糖基結合位點與這些不發(fā)生抑制作用的糖之間不存在親合性。相反,能發(fā)生抑制作用的糖,則可被認為其結構互補于所作用的凝集素,進而確定凝集結合部位對糖的特異性。

3.4 一些二價金屬離子的參與往往有助于多種凝集素的凝集作用[25],因此 EDTA可能會強烈抑制凝集素的活力,實驗結果表明,香螺的 3種凝集素受EDTA不同程度的抑制,這與牟海津等[26]的研究結果一致。說明這 3種凝集素分子中均含有維持活性所必需的一種或多種金屬離子,實驗結果還表明了, Mn2+、Mg2+和 Ca2+對 3種凝集素的凝集活性沒有明顯的影響,即無信賴性。而只有 Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素對家兔紅細胞的凝集活力。這可能就是由于這 3種凝集素的凝集作用不需要Mn2+、Mg2+和 Ca2+的參與,而肌肉和血清凝集素的凝集作用卻與 Zn2+有很大的關系。再次說明了無脊椎動物凝集素的凝集作用常常需要一些二價金屬離子的參與[27]。本實驗還發(fā)現,在一定范圍內的鹽度可以改變香螺肌肉凝集素的凝集效價。在鹽度為 12～18 g/L之間可提高香螺肌肉凝集素的凝集活性, Tamplin[28]等在研究美洲巨蠣的血清對霍亂弧菌的凝集作用發(fā)現適當增加反應液的鹽度 24～30 g/L,可以提高凝集效價。牟海津等[26]發(fā)現在一定范圍內增加鹽度可提高中國對蝦血淋巴的凝集效價的研究結果相似,而在鹽度為 24 g/L以上,活性效價就開始下有所下降。這其中的原由還有待進一步的研究。

通過對香螺的肌肉、血清和唾液腺凝集素的比較研究,發(fā)現三者的性質等方面存著著較大的差異,所以要進一步的了解三者具體的類型、物理化學結構等,還有待分離純化等的深入研究。

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A Prel im inary Study on Agglutination of Agglutin ins of Serum,M uscular and Salivary Gland fromNaptunea cum ingicrosse

CHEN Lin,XU Gao-yun,RAO Xiao-zhen,CHEN Yin-shan＊
College of Life Sciences,Fujian Nor m alUniversity,Fuzhou 350108,China

Serum,muscular and salivary gland agglutinins extracted fromNaptunea cum ingicrossewere tested for agglutinating activities using 7 kinds of an imal erythrocytes,4 kinds of human erythrocytes,4 species of unicellular algae,and 11 species ofmicrobe.Meanwhile the sensibility of pH,thermostability,sugar-inhibiting action,the effect of EDTA,metal hydronium and salinitywere detected.The results showed that therewere differences in the agglutinating activitieson various cells in 3 agglutinins,and the rabbit erythrocyteswere the most sensitive to 3 agglutinins.The agglutinating activities ofmuscule and serum agglutininswere disappeared in pH＜7.0 condition.The thermostability of salivary gland agglutinin was the highest,stillwith activities at 90℃.Besides,3 agglutinins showed different results in the sugar-inhibiting experiments.The agglutinating activities of 3 agglutininswere inhibited in the range of 2.00-0.25 mmol/L EDTA.It was found that Zn2+could improve the agglutinating activities ofmuscle and serum agglutinins,but restrain the salivary gland agglutinin.When the salt concentration was at 12-18 g/L,the muscle agglutinin agglutination could be increased, and itwas be inhibited at the concentration of 24-60 g/L.

Naptunea cum ingicrosse;agglutinin;agglutinating activity;characteristics.

R284.2

A

1001-6880(2010)04-0651-08

2009-10-12 接受日期:2010-04-08

福建省科技廳資助項目(2005K018)

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