遠志中遠志酸含量影響因素初探

趙云生,萬德光,裴 瑾,李占林,田洪嶺,任志萍

1成都中醫(yī)藥大學藥學院,成都 610075;2山西省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所;3山西省汾陽市疾控中心,汾陽 032200

遠志中遠志酸含量影響因素初探

趙云生1,2,萬德光1＊,裴 瑾1,李占林2,田洪嶺2,任志萍3

1成都中醫(yī)藥大學藥學院,成都 610075;2山西省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所;3山西省汾陽市疾控中心,汾陽 032200

采用 HPLC法測定遠志藥材、根心、遠志葉中遠志酸含量,考察產(chǎn)地、緯度、海拔、生長期、采收期以及遠志不同生長部位對遠志酸含量的影響,探討遠志中遠志酸含量影響因素。結(jié)果表明:產(chǎn)地、采收期以及遠志不同生長部位對遠志酸含量的影響達極顯著水平,緯度與海拔對遠志酸含量具有一定影響。遠志生產(chǎn)應選擇適宜產(chǎn)區(qū),適時采收,遠志Polygala tenuifoliaW illd根心與卵葉遠志P.sibiricalL.葉中含有一定的遠志酸,具有開發(fā)價值。

遠志;遠志酸;影響因素;HPLC

遠志始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有安神益智,祛痰,消腫的作用,是我國傳統(tǒng)出口藥材,也是國家 42種重點保護的三級野生品種之一,《中國藥典》2005年版收載遠志基源為遠志Polygala tenuifoliaW illd和卵葉遠志P.sibiricalL.,以遠志酸含量作為遠志質(zhì)量控制的指標[1]。

本實驗研究了遠志藥材 (去心根皮)、根心、遠志葉中遠志酸含量變化,對遠志中遠志酸積累影響因素進行了探討,以期更好地開發(fā)和利用我國遠志資源,為遠志規(guī)范化種植及新藥源的擴大提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安公司 Summit HPLC,Detector UVD 170U, Column Thermostat TCC-100;浙江大學 N2000色譜數(shù)據(jù)工作站,索氏提取器。

1.2 試藥

對照品:遠志酸 (成都中醫(yī)藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室提供)。

樣品:遠志藥材 21份 (野生樣品 16份,栽培樣品 5份),根心 5份,葉 11份。野生樣品均采自2007年 10～11月,分布于向陽的山中坡地或平原深溝坡地,伴生植物低矮,大多不高于 40 cm,與遠志雜生,土層深厚,砂質(zhì)或略黏壤土。栽培遠志種植于山西省農(nóng)科院經(jīng)作所試驗田。

所有樣品由成都中醫(yī)藥大學萬德光教授鑒定為遠志Polygala tenuifoliaWilld和卵葉遠志P.sibiricalL。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

采用 18烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Welchrom C18(5μm,250 mm×4.6 mm);流動相甲醇-0.2%磷酸溶液 (70∶30);檢測波長 210 nm;理論塔板系數(shù)以遠志酸計 7190;流速:lmL/min;柱溫 30℃;進樣量:遠志藥材 5μL、根心或葉 20μL。標準品及樣品色譜圖見圖 1。

圖 1 遠志標準品(上)與樣品(下)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard(above)and sample (low)

2.2 供試品溶液的制備

取 60℃下干燥至恒重的遠志粉末 (4號篩)約1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加甲醇 100 mL,回流 5 h,減壓回收甲醇至干,殘渣加 10%稀鹽酸 20 mL,沸水浴回流 2 h,冷卻,過濾并用蒸餾水洗滌沉淀至中性,用甲醇溶解沉淀并定容至 10 mL,即得供試品溶液[2,3]。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取遠志酸對照品 3.74 mg,置 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得 (每 1 mL含遠志酸 374μg)。

2.4 標準曲線的繪制

分別精密吸取對照品溶液(0.374 mg/mL)1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μL進樣,按上述色譜條件測定,以對照品質(zhì)量 (X)為橫坐標,峰面積積分值(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,經(jīng)回歸處理,得回歸方程:Y=3.8663X-0.3909,r=0.9999,遠志酸在0.374～11.22μg與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一遠志供試品溶液,按上述色譜條件連續(xù)進樣 6次,每次 5μL,測定峰面積,RSD= 0.38%,表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一遠志藥材供試液,室溫放置,在上述色譜條件下,分別在 0、3、6、9、12、24 h進樣 1次,每次 5 μL,測定峰面積,計算遠志酸含量,共考察24 h,RSD =0.31%,表明樣品溶液在至少 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一樣品 6份,分別按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,按上述色譜條件測定遠志酸含量,RSD=2.87%,表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的遠志藥材粉末各 0.5 g,共6份,按供試品溶液制備方法制得供試液,精密加入遠志酸對照品溶液(濃度為 0.374 mg/mL)1 mL,按上述色譜條件測定遠志酸含量,計算回收率,結(jié)果遠志酸平均回收率為 98.45%,RSD=2.80%(表 1)。

表 1 回收率試驗(n=6)Table 1 Recovery test(n=6)

2.9 樣品測定

分別取制備好的樣品溶液,按上述色譜條件,進樣,測定,記錄遠志酸峰面積,計算遠志酸含量。

3 遠志中遠志酸含量影響因素探析

采用 Excel計算各樣品遠志酸含量,采用SPSS13.0進行 F測驗,比較各樣品間遠志酸含量差異,試驗結(jié)果見表 2～4。

3.1 產(chǎn)地對遠志酸含量的影響

對山西、陜西、甘肅、四川四省 16份藥材遠志酸含量測定結(jié)果表明 (表 2),不同產(chǎn)地遠志酸含量差異達極顯著水平 (P=0.01,n=3),產(chǎn)地對遠志次生代謝產(chǎn)物遠志酸含量影響顯著。

3.2 緯度與海拔對遠志酸含量的影響

海拔高度(422～2309 m)與緯度 (31°41′～39° 31′)對遠志酸含量具有一定影響 (圖 2)。海拔高度在 422～698 m時遠志酸含量較高,均大于 1%,其余海拔高度遠志酸含量一般不大于 1%。緯度對遠志酸積累的影響呈波浪形變化,緯度 34°09′～35° 52′、37°15′～39°31′,隨著緯度的增高,遠志酸含量呈下降趨勢,在緯度 35°52′～36°50′,遠志酸含量呈上升趨勢,總體上來說遠志酸含量在緯度 34°09′～35°20′區(qū)間含量較高,大于 1%,該緯度區(qū)間山西聞喜、陜西西安等地也是遠志主產(chǎn)區(qū),可能與這些地區(qū)夏季高溫干燥的氣候環(huán)境有利于遠志有效物質(zhì)群的積累有關,可以選擇這一區(qū)域建立遠志 GAP生產(chǎn)基地,遠志酸含量在其余緯度區(qū)間一般不高于 1%。

遠志酸是遠志皂苷的水解產(chǎn)物,不同海拔地區(qū)遠志酸含量存在一定差異,變化幅度 0.45%～1.59%,平均含量 0.86%。海拔高度在 422～698 m的地區(qū)遠志酸含量明顯高于其余海拔地區(qū),隨著海拔升高,遠志酸含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢。

遠志酸的積累通常是在一定的海拔高度與緯度下共同作用的結(jié)果,將二者結(jié)合起來分析,能夠進一步接近遠志酸積累的實際狀況,為此將遠志分布的緯度與海拔高度分別進行加權換算,以最高緯度39°31′與最高海拔高度 2309 m的加權數(shù)均為 1,通過下式進行換算:某遠志加權數(shù) =該遠志緯度/39° 55′+該遠志海拔高度 /2309

以遠志加權數(shù)為橫坐標,遠志酸含量為縱坐標,繪制散點圖 (圖 2),緯度與海拔加權數(shù)大于 1.05時,隨著加權數(shù)的增加,遠志酸含量具有逐漸降低的趨勢,緯度與海拔加權數(shù)在 1.05～1.20、1.42時遠志酸含量均較高,大于 1%。

3.3 生長期與采收月份對遠志酸含量變化的影響

該試驗以栽培遠志“汾遠 1號”為試驗材料,在大田栽培條件下進行試驗,方差分析表明,不同生長時間與采收月份,遠志酸含量達極顯著差異 (P= 0.01,n=3),7月份采收遠志的遠志酸含量極顯著高于其它月份采收的遠志,由表 3可知,遠志在 7、8、9月份采收,遠志酸含量均顯著高于 10、11月份采收的遠志,在 10月份與 11月份采收遠志,遠志酸含量相差不顯著 (P=0.05,n=3)。

由遠志不同生長時間可知,生長 2個月遠志與生長 8個月遠志遠志酸含量差異不顯著,說明遠志酸積累與遠志生長時間可能關系不大,而與遠志收獲時期關系密切,由于“汾遠 1號”為系選材料,親緣關系一致,生長于同一塊試驗田中,遠志生長環(huán)境比較一致,因而遠志酸含量差異只能由兩個因素造成,一為遠志生長發(fā)育階段,二為遠志采收時期,本實驗結(jié)果表明,遠志酸生物積累可能與遠志收獲時期有關,而與遠志生長發(fā)育階段關系并不密切。7月份采收遠志酸含量較高,說明生產(chǎn)地在 6～7月份的高溫干燥環(huán)境能夠刺激遠志酸生物合成的各種關鍵酶,從而提高遠志酸的生物積累,同一份試驗材料在 7月份采收時遠志酸含量顯著高于 10月份遠志,說明外界環(huán)境條件改變時,已經(jīng)合成的遠志酸能夠自行分解,可見在進行遠志規(guī)模化生產(chǎn)時,選擇適宜的采收時期比生長時期更為重要,采收期對遠志藥材質(zhì)量影響較大。

表 3 不同生長期與采收時間藥材(去心)與根心遠志酸含量(n=3)Table 3 Content of polygalacic acid in different vegetative period and harvest time(n=3)

3.4 遠志根心中遠志酸含量變化

遠志根心中含有一定量的遠志酸 (表 3),以 7、10兩個月份采收的遠志根心,遠志酸含量較高,其余月份相差不大,遠志根心中遠志酸積累模式與遠志藥材(遠志根皮)有所區(qū)別,遠志根心在 8～10月份遠志酸含量逐漸增加,與遠志藥材中遠志酸積累模式正好相反,遠志根心與遠志藥材遠志酸積累模式是否具有相關性,有待進一步研究。遠志根心與遠志藥材在 7月份采收時遠志酸含量均較高,說明產(chǎn)區(qū) 6～7月份的生態(tài)因子有利于遠志酸生物合成。

3.5 遠志葉中遠志酸含量變化

對不同產(chǎn)地遠志葉中遠志酸含量測定表明 (表4),不同產(chǎn)地遠志 (Polygala tenuifoliaW illd)葉中遠志酸含量均非常低,幾乎不含有遠志酸,但四川荗縣與九龍山卵葉遠志葉 (P.sibiricalL.)中遠志酸含量較高,達 0.4%以上,具有一定的開發(fā)價值。遠志與卵葉遠志葉中遠志酸含量差異說明二者種間的遺傳差異影響到了葉中化學成分的生物合成。

表 4 遠志葉中遠志酸含量(n=3)Table 4 Content of polygalacic acid in leaves of P.tenuifolia orP.sibiricain different habitats(n=3)

4 討論與小結(jié)

4.1 遠志酸含量積累受產(chǎn)地影響顯著,生產(chǎn)中對遠志產(chǎn)區(qū)的強調(diào)十分必要。遠志酸積累受采收期影響較大,生長期對遠志酸積累影響可能并不大。

4.2 遠志不同生長部位對遠志酸含量影響極大,遠志藥材(去心)遠志酸含量遠大于遠志根心與遠志葉,遠志酸能在遠志根心中產(chǎn)生一定積累,在進行遠志提取物生產(chǎn)時,可以將遠志根心作為原料使用。遠志 (Polygala tenuifoliaW illd)葉中遠志酸積累非常少,但卵葉遠志葉 (P.sibiricalL.)中遠志酸含量稍高。

4.3 海拔高度與緯度對遠志酸含量積累的影響主要是通過影響溫度與光照實現(xiàn),由于遠志酸積累是一個復雜的生物學過程,受多種因素影響,除海拔與緯度外,還受產(chǎn)區(qū)海陸位置、地形、季風、土壤以及遠志遺傳特征等等因素的影響,因而進行遠志生產(chǎn)應多種因素綜合考慮。

4.4 遠志根心與遠志藥材在 8～10月份遠志酸積累趨勢相反,二者有無相關性,有待進一步研究。

1 China Phar macopoeia.First Part(中國藥典,一部),2005. 107-108.

2 Liu YP(劉友平),Wan DG(萬德光),Song Y(宋英).Determination of dehydroxypresenegenin inPolygalae teuuifoliaby HPLC.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥),2001,32:786-787.

3 Liu YP(劉友平),Wan DG(萬德光),Liu T(劉濤),et al. The contentof total saponinsofPolygalae teuuifoliafrom different habitats was determined by spectrophotometry.J Chengdu Univ TCM(成都中醫(yī)藥大學學報),2000,23(2): 46-47.

Study on Some Influence Factors of Polygalacic Acid Content inPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.

ZHAO Yun-sheng1,2,WAN De-guang1＊,PEIJin1,L I Zhan-lin2,T IAN Hong-ling2

1College of Phar macy,Chengdu University of Traditional ChineseM edicine,Chengdu 610075,China;2Industrial Crop Research Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences;3Fenyang Centers forD isease Prevention&Control,Fenyang 032200,China

The polygalacic acid was deter mined to study its influence factors in medicinalmaterials,root xylem and leaves ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.by HPLC,and the factorswere investigated about the growing area,latitude,elevation,the period of growth or harvesting and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.. The results showed that the difference of growing area,harvesting period and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.is significant at the 0.01 level,latitude and elevation has some impact.The geo-authentic producing areas should be chosen in Radix Polygalae production,and it should be harvested timely.The root xylem ofPolygala tenuifoliaW illd and the leaves ofP.sibiricalL.have some polygalacic acid and development value.

Polygala tenuifoliaW illd;P.sibiricalL.;polygalacic acid;influence factors;HPLC

R917;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0634-05

2008-09-16 接受日期:2009-02-09

山西省科技攻關項目(2006031080-1);山西省自然科學基金項目(2007011091)

＊通訊作者 Tel:86-28-87779801;E-mail:wdg@cdutcm.edu.cn