異補骨脂素加鋅對大鼠成骨細胞相關細胞因子表達影響的實驗研究

王建華,張軍芳,呂 萍,王雅楠

河北醫科大學藥學院河北醫科大學中西醫結合研究所,石家莊 050017

異補骨脂素加鋅對大鼠成骨細胞相關細胞因子表達影響的實驗研究

王建華＊,張軍芳,呂 萍,王雅楠

河北醫科大學藥學院河北醫科大學中西醫結合研究所,石家莊 050017

為探討異補骨脂素加鋅對體外培養新生大鼠顱骨成骨細胞相關基因表達的影響,用改良的組織塊培養法分離培養新生大鼠顱骨成骨細胞,在成骨細胞體系中加入異補骨脂素與鋅,以雌激素為陽性對照,空白組為陰性對照。結果顯示:異補骨脂素加鋅較單純應用異補骨脂素或硫酸鋅在 48 h時促體外大鼠成骨細胞Ⅰ型膠原的表達;異補骨脂素加鋅組可以明顯上調大鼠成骨細胞 TGF-β1的細胞信號轉導因子 Smad4 mRNA的表達(P＜0.01);能促進 Runx2/Cbfa1 mRNA的表達 (P＜0.05)。與空白對照組相比,異補骨脂素組,異補骨脂素加鋅組均能增強OsterixmRNA的表達 (P＜0.05)。與單純應用異補骨脂素或者鋅相比,異補骨脂素與鋅聯合應用能夠協同增效,對促進體外培養的成骨細胞相關轉錄因子的表達更加明顯,探討了異補骨脂素及其與鋅配伍調節骨代謝的分子機制,為提高骨質疏松癥的臨床療效以及抗骨質疏松新藥的開發提供了實驗依據。

成骨細胞;異補骨脂素;鋅;I型膠原(COL I);核心結合因子 (Runx2/Cbfa1);Osterix;Smad4

植物雌激素是存在于一些植物中的具有雌激素效能的化合物。中藥補骨脂具有溫脾止瀉、溫補腎陽之功效,其所含有的化合物補骨脂素 (psoralen)和異補骨脂素 (isopsoralen)屬香豆素類植物雌激素,在體內能結合雌激素受體,并發揮一定的生物學效應。補骨脂素對促進大鼠成骨細胞增殖和提高堿性磷酸酶活性有較好的作用[1]。鋅,是維持機體正常生理功能和內環境正常生化代謝所必需的微量元素,也是骨代謝中不可缺少的重要微量元素之一,它可以有效刺激成骨細胞的骨形成和抑制破骨細胞的骨吸收[2],鋅能夠促進體外培養大鼠成骨細胞的增殖及分化[3]。

本課題組前期的研究結果顯示異補骨脂素和鋅制劑協同具有促進成骨細胞增殖與分化的作用,其作用優于單純應用異補骨脂素或鋅制劑[4]。本文繼續報道異補骨脂素與鋅聯合應用對成骨細胞相關基因表達的影響,以探討香豆素類植物雌激素與鋅配伍調節骨代謝的分子生物學機制,為指導臨床用藥以及防治骨質疏松藥物的研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生 24 h內 SD系乳大鼠:性別體重不限。河北醫科大學實驗動物中心提供,動物合格證號: 800100。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養基,胰蛋白酶 (G IBCO);胎牛血清(杭州四季青);Ⅱ型膠原酶,十二烷基磺酸鈉(SDS),dNTP,Tris堿 (Sigma公司);雌激素,異補骨脂素 (中國藥品生物制品檢定所);硫酸鋅 (zine sulfate)(天津市化學試劑公司 );焦碳酸二乙酯(DEPC),T IANScriptM-MLV,Oligo(dT)15,TagDNA Polymerase,DNA ladder,Loading Buffer(T IANGEN公司產品);Redzol總 RNA提取試劑 (北京賽百盛基因技術公司);瓊脂糖,Rnasin(Promega公司產品); EDTA(Boehringer分裝);冰醋酸,異丙醇,三氯甲烷,95%分析純乙醇(國產試劑)。PCR引物均為上海生工生物技術有限公司產品(表 1)。

表1 PCR引物Table 1 PCR sense

XDS-1B型倒置相差顯微鏡(OLY MPUS);二氧化碳培養箱(美國NATURE公司);7230G型紫外可見分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司);DYY-12型三恒多用電泳儀(北京市六一儀器廠);PCR儀(英國 TECHNE公司)。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細胞的培養及鑒定

無菌條件下,取出生 24 h內的 SD大鼠乳鼠顱蓋骨,用平衡鹽溶液 PBS沖洗數次,放入 0.25%的胰蛋白酶溶液中,剔除骨表面被膜及軟組織,將骨片剪成 1～3 mm3的骨粒,棄去胰蛋白酶溶液。在0.1%膠原酶Ⅱ中室溫消化 45 min,將消化液棄去,平衡鹽溶液 PBS洗三遍。將骨粒分散于 100 mL培養瓶中,加入含 20%胎牛血清的DMEM培養液,37℃5%CO2培養箱中培養。5 d后,將骨粒棄去,細胞進行傳代培養,將細胞用胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的 DMEM培養基吹打傳代,置于細胞培養瓶中放入培養箱中繼續培養。

細胞傳至第 5代,通過細胞形態學觀察及堿性磷酸酶細胞化學染色鑒定所用細胞為成骨細胞[5],成骨細胞的純度達到 90%以上。

1.4 檢測方法

1.4.1 成骨細胞中總 RNA的提取、鑒定和定量

細胞經過 0.25%胰蛋白酶消化,用含 10%胎牛血清的 DMEM培養基稀釋到 5×104/mL接種于100 mL培養瓶中,常規培養 2 d換含異補骨脂素和鋅的無血清培養基繼續培養 48 h,采用 Redzol試劑進行總 RNA提取。棄上清,每瓶用平衡鹽溶液 PBS沖洗后加 1 mL Redzol裂解細胞,然后轉移至新的離心管中,室溫放置 5 min。各管加入 0.2 mL氯仿,混勻后放置 3 min。4℃,12000 r/min離心 15 min,小心吸取上層水相至一新管中,加入 0.5 mL異丙醇混勻,靜置 10 min。4℃,12000 r/min離心 10 min,去上清,RNA沉淀于管底,加入 1 mL預冷的 75%乙醇(DEPC處理過的水配制)洗沉淀,4℃,7500 r/min離心 5 min,棄上清,空氣干燥 3～5 min,加入 30 mL DEPC處理過的三蒸水溶解所提取的 RNA樣品。

取 5μL RNA溶液,進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察 RNA的純度和完整性。另取 5μLRNA溶液倍數稀釋后,測其在 260 nm,280 nm波長下的吸光度,計算總 RNA的含量和 OD260/ OD280的比值以了解其純度,確保所提總 RNA完好。剩余樣品用于 RT-PCR。

1.4.2 反轉錄反應合成 cDNA

反轉錄反應體系 (20μL體積)包括:dNTP(10 mM)1μL,Rnasin(30 U/μL)1μL,Oligo(dT)15 (10μM)2μL樣品 RNA 1μg,三蒸水補足至 14 μL,70℃水浴 5 min,立即冰上冷卻 2 min。再分別加入 5×First-Strand Buffer 4μL,DTT(0.1 M)1 μL,M-MLV(10 U/μL)1μL,混勻,42℃50 min充分反應,95℃5 min(以滅活逆轉錄酶),反轉錄后產物置-20℃冰箱保存、備用。

1.4.3 PCR擴增

PCR反應體系 (50μL體積)如下:反轉錄產物2μL,10×Taq Buffer 5μL,dNTP(10 mM)1μL,目的基因上下游引物 (25 pmol/L)各 1μL(同管擴增時再加內參上下游引物各 1μL),Tag DNA polymerase(5 U/μL)0.3μL,加三蒸水 39.7μL(同管擴增加37.7μL)補至終體積 50μL。最后加封石蠟油約25μL。循環條件:首次 94℃5 min;94℃30 s,58℃60 s,72℃60 s共 35個循環;最后延長 72℃6 min。

1.4.4 PCR產物分析

PCR產物 10μL加 2μL 6×Loading Buffer進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并至凝膠成像儀中照相。照片進行光密度和面積掃描。計算每一樣品和其內參對照的相對含量。

1.5 數據處理

使用 SPSS 13.0 for windows統計軟件,所有數據均以±s表示。

2 結果

2.1 異補骨脂素和鋅對成骨細胞 I型膠原mRNA表達的影響

異補骨脂素加鋅組能促進 COL ImRNA的表達,異補骨脂素加鋅組的相對表達量為 0.639,與空白對照組相比有統計學意義 (P＜0.01),且效果顯著。雌激素組和異補骨脂素組均能促進 I型膠原mRNA表達,但二者之間沒有明顯差別 (見圖 1及表 2)。

2.2 異補骨脂素和鋅對成骨細胞 Osterix表達的影響

與空白對照組相比,雌激素組,異補骨脂素組,異補骨脂素加鋅組均能增強 Osterix mRNA的表達(P＜0.05),異補骨脂素加鋅組表達量 1.194高于雌激素組和異補骨脂素組 (P＜0.01)(見圖 2及表2)。

2.3 異補骨脂素和鋅對成骨細胞 Runx2/Cbfa1 mRNA表達的影響

空白組Runx2 mRNA/GAPDH mRNA的相對表達量為 0.188,雌激素組的相對表達量 0.942,與空白對照組相比,能顯著促進Runx2 mRNA的表達 (P＜0.01);而異補骨脂素加鋅組的相對表達量為0.7702,與空白對照組相比能明顯促進 Smad4 mRNA的表達 (P＜0.05);配伍組的相對表達量高于單純使用異補骨脂素組 (見圖 3及表 2)。

2.4 異補骨脂素和鋅對成骨細胞 TGF-β信號轉導蛋白 Smad4表達的影響

與空白對照組相比,雌激素組、異補骨脂素與異補骨脂素加鋅組均能明顯促進 Smad4 mRNA的表達 (P＜0.01);異補骨脂素加鋅組、異補骨脂素組和雌激素組比較沒有明顯的差別,但可觀察到雌激素組的表達量相對較高 (見圖 4及表 2)。

3 討論

轉化生長因子β信號通路調節許多過程,包括細胞的增殖,粘附和分化、造血、炎癥反應、創傷愈合和骨骼發育。Smad4是 TGF-β家族中信號通路中通用的細胞內信號轉導分子,是促進其轉導過程的重要中轉分子之一[6],研究發現成骨細胞中特異性剔除 Smad4基因的小鼠成骨細胞和破骨細胞明顯減少,骨形成和骨吸收下降,導致小鼠早期發生骨質疏松[7]。異補骨脂素組與配伍加鋅組均可誘導成骨細胞的分化,促進成骨細胞分泌 TGF-β1的同時,上調 Smad4 mRNA的表達,表明成骨細胞存在Smad4基因表達,推測異補骨脂素以及配伍組促進成骨細胞增殖與分化,增強成骨功能,促進骨形成,可能是通過干預 TGF-β1及其信號轉導分子 Smad4的表達而實現的。

圖 3 大鼠成骨細胞 Runx2/Cbfa1 mRNA與 GAPDH mRNA的表達Fig.3 Product of RT-PCR of Runx2/Cbfa1 mRNA and GAPDH mRNA in rat calvaria-derived osteoblast

圖4 大鼠成骨細胞Smad 4 mRNA與 GAPDH mRNA的表達Fig.4 Product of RT-PCR of Smad 4 mRNA and GAPDH mRNA in rat calvaria-derived osteoblast

表 2 大鼠成骨細胞各目的基因的相對表達量Table 2 Products of RT-PCR in rat calvaria-derived osteoblast

近年的研究發現,核心結合因子α1(core-binding factorα1,Cbfa1)決定著成骨細胞的發生與分化,是成骨分化關鍵性的轉錄因子,它在維持正常的骨骼生長發育中起著重要作用。Cbfa1基因敲除純合子小鼠完全缺乏骨組織,骨內無礦化中心出現;在非成骨細胞如皮膚成纖維細胞過表達 Cbfa1,可誘導出成骨細胞特異性標志物如Ⅰ型膠原α1、骨涎素和骨鈣素的表達;相反,若阻斷成熟成骨細胞中 Cbfa1的表達,可使成骨細胞標志物的表達下降,并阻斷其成骨過程。Cbfa1/Runx2能在非成骨細胞或成骨前體細胞上調成骨分化相關基因的表達。Osterix (OSX)是 2002年 Nakasllima[8]等發現的一種含有鋅指結構的轉錄因子,OSX只在發育的骨組織中特異性表達,在 OSX基因剔除小鼠胚胎中,成骨細胞的分化受到阻礙,各種標志物的表達水平嚴重降低,可見在OSX基因剔除胚胎中成骨細胞分化、成熟受到抑制從而導致了骨形成的缺失,它是成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的關鍵物質。有學者認為OSX可能是 sox9和軟骨細胞的一種負向調控子,可阻止骨/軟骨祖細胞向軟骨細胞的分化。Cbfa1和Osterix在調控靶基因表達過程中有相互作用的關系,瞬時表達 Cbfa1能夠誘導 Osterix的表達。在骨髓間充質細胞向成骨細胞分化過程中 Runx2/Cbfa1能直接刺激相關基因的轉錄,在 Runx2基因剔除小鼠軟骨內骨骼成分的骨膜中未檢測到OSX的轉錄產物,但 Runx2在 OSX失活胚胎中的表達卻正常,因此人們推測OSX在胚胎發育成骨過程中出現比Runx2/Cbfa1晚,位于成骨細胞分化路徑中它的下游。間充質祖細胞首先分化為前成骨細胞,在這一過程中 Cbfa1和 Cbfβ (core binding factor beta, Cbfβ)發揮決定作用[9],在這個階段,前成骨細胞是雙潛能細胞可以分化為成骨細胞或者成軟骨細胞, OSX的參與可使它們分化為成熟的成骨細胞。成骨細胞標志性基因包括 I型膠原、骨鈣素 (OC)、骨涎蛋白(BSP)等表達的蛋白構成了骨基質。

通過以上分析及實驗結果顯示,成骨細胞的骨形成可能通過 Smad4影響 TGF-β1的信號傳導通路;Cbfa1以及其他調控因子與下游的 OSX一起激活成骨細胞標志性基因 I型膠原的表達,從而促進骨基質的形成。

補骨脂性辛溫、微苦、入腎經,具有溫脾止瀉、溫補腎陽之功效,臨床應用情況及現代藥理研究均證實補骨脂確有強筋骨,防治骨質疏松的作用。補骨脂的性成分主要為補骨脂素 (psoralen)、異補骨脂素(isopsoralen),屬于香豆素類植物雌激素,在體內結合雌激素受體而發揮一定的生物學效應。本文探討了異補骨脂素加鋅防治骨質疏松癥的分子機制,配伍組與單純異補骨脂素組相比其表達量更高,說明鋅離子在成骨細胞的分化成熟過程中確實發揮了促進作用,而OSX便是一種具有鋅指基序結構域的轉錄因子,推測其機理可能與鋅指結構有關,大多數含有鋅指結構蛋白質的確切功能以及他們是否具有其他方面的功能尚不清楚,深入研究可能會有助于推進抗骨質疏松藥物的研發工作。目前仍然有很多問題未解決,骨質疏松癥的分子生物學機制尚需深入研究。

1 Wang JH(王建華),Wang Y(王艷),Pan Y M(潘永梅). Effects of psoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblastsin vitro.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),2007,19:844-846.

2 YamaguchiM,Uchiya Ma S.Receptor activator of NF-κB ligand-st imulated osteoclastogenesis in mouse marrow culture is suppressed by zincin vitro.Int J M olM ed,2004,14:81-85.

3 Cen XB(岑小波),Wang RS(王瑞淑),Wu ZF(吳兆鋒). Zinc promotesproliferation and differentiation of osteoblast in ratsin vitro.Chin J PreventiveM ed(中華預防醫學雜志), 1999,33:221-223.

4 Zhang JF(張軍芳),Guo M(郭敏),Wang JH(王建華). Effects of isopsoralen plus zinc on proliferation and differentiation of cultured osteoblastsin vitro.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),in press.

5 Situ ZQ(司徒鎮強),Wu JZ(吳軍正).Cell Culture(細胞培養).Xi’an:World Book Publishing Company,2004.160-164.

6 KretzschmarM,Liu F,Hata A,et al.The TGF-βfamilymedlator Smad lisphosphorylated directly and activated functionally byBMP receptor kinase.Genes Dev,1997,11:984-995.

7 Yang X(楊曉).The function of Smad4 mediated transforming growth factor-β in regulating bone development and maintaining bone homeostasis.Chin Bull Life Sci(生命科學),2008,20:165-169.

8 Nakasllima K,zhou X,Kunkel G,et al.The novel zinc fingercontaining transcription factor osteoblast differentiation and bone formation.Cell,2002,108:17-29.

9 Komori T.Requisite roles of Runx2 and Cbfβin skeletal development.J BoneM inerM etab,2003,21:193.

Effect of Isopsoralen Plus Zinc on the Expression of Related O steoblasts Factors

WANG Jian-hua＊,ZHANG Jun-fang,LV Ping,WANG Ya-nan
Faculty of Phar m acy,HebeiM edical University,Shijiazhuang 050017,China

To study the effects of isopsoralen plus zinc on the gene expression of related osteoblasts factors, Improved tissue block culture were used to demesh and cultivate osteoblasts in cranial bone of newly born SD rats.RT-PCR technologywas used to detect isopsoralen and zinc on osteoblasts related protein(COL I)mRNA,Smad4 mRNA,Cbfa1/Runx2 mRNA,OsterixmRNA expression.Itwas demonstrated that combination of isopsoralen and zinc could synergistically enhance the expression of cultured osteoblasts related osteoblasts factorsin vitro.From the cellular and molecular level to explore osteoporosismechanis m applying isopsoralen and zinc,with a view to improve osteoporosis clinical efficacy as well as anti-osteoporosis drug development in the future.

osteoblast;isopsoralen;zinc;COL I;Runx2/Cbfa1;Osterix;Smad4

R285.5;Q946.91

A

1001-6880(2010)03-0403-05

2009-05-11 接受日期:2009-07-07

河北省自然科學基金(C2009001072);河北省科學技術研究與發展計劃項目 (09276418D-14);河北省中醫藥管理局課題(2007116)

＊通訊作者 Tel:86-311-86265628;E-mail:s mith_Wang2000@126.com