滇姜花二萜成分的抗腫瘤活性研究

趙 慶,賀小瓊,郝小江,鄒 澄＊

1云南中醫學院中藥學院,昆明 650200;2中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室,昆明 650204;3昆明醫學院藥學院,昆明 650031

滇姜花二萜成分的抗腫瘤活性研究

趙 慶1,2,賀小瓊3,郝小江2,鄒 澄3＊

1云南中醫學院中藥學院,昆明 650200;2中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室,昆明 650204;3昆明醫學院藥學院,昆明 650031

對滇姜花粗提物、滇姜花素A(1)和姜花酮(2)進行了動物體內抗腫瘤活性測試,結果表明它們均能顯著性抑制小鼠體內移植性腫瘤 H22的生長,其中滇姜花素 A對小鼠 H22腫瘤生長抑制率達 54.27%,作用最強。體外抗腫瘤實驗發現,滇姜花素 C(3)對體外培養的人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231具有較強的細胞毒作用,并具有明顯的劑量效應關系。

滇姜花;滇姜花素A;滇姜花素 C;姜花酮;抗腫瘤活性

國內外已對姜科姜花屬植物抗腫瘤活性二萜成分進行了一些研究。日本學者曾從姜花屬植物姜花中分離得個數個對 V-79細胞具有體外抗腫瘤活性的成分[1]。我們曾對姜花屬植物滇姜花和圓瓣姜花根莖的化學成分進行了研究,分離得到了多個萜類成分[2-7];并對一部分二萜成分進行了對 KB細胞的細胞毒活性篩選,大部分被篩選的成分顯示有活性,其中二萜成分滇姜花素B、C對 KB細胞的細胞毒活性十分顯著[3,4]。此后我們又從圓瓣姜花中分離得到了數個二萜成分,其中部分二萜成分對 K-562細胞和A-549細胞顯示了顯著的體外細胞毒活性[6]。到目前為止,對姜花屬二萜成分的抗腫瘤活性研究僅僅局限于體外抗腫瘤實驗,尚未見到有關體內抗腫瘤活性的研究報道。因此,我們十分關注姜花屬二萜成分是否具有體內抗腫瘤活性,并開展了相關的研究工作。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

滇姜花根莖樣品采于云南省昆明市,植物標本由中國科學院昆明植物研究所童紹全研究員鑒定為Hedychium yunnanense Gangep.,保存于中國科學院昆明植物研究所植物化學實驗室。

取滇姜花根莖樣品 14 kg用 95%乙醇回流提取三次。乙醇提取物依次用石油醚提取三次,乙酸乙酯提取一次,正丁醇提取三次。石油醚提取部分共805 g,取其中 500 g經硅膠柱層析、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫,其中的石油醚-乙酸乙酯(40:1)洗脫部分再經氧化鋁柱層析、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫,得到姜花酮 (1)14 g,滇姜花素A(2)3.2 g。石油醚-乙酸乙酯(2:1)洗脫部分再經硅膠柱層析、氯仿-甲醇 (80:1)洗脫,得滇姜花素 C(3)210 mg。上述三個化合物經核磁共振法測試為純品,純度均在 95%以上。另取 200 g滇姜花根莖樣品用 95%乙醇回流提取三次,提取液濃縮后得滇姜花粗提物 12 g。

圖 1 化合物 1～3的化學結構Fig.1 Structures of compound 1-3

在小鼠體內抗腫瘤實驗中,滇姜花粗提物、滇姜花素A和姜花酮以二甲基亞砜(DMSO)溶解進行實驗,使用劑量分別為 100、50、50 mg/kg。在體外細胞培養抗腫瘤實驗中,滇姜花素 C以 DMSO溶解,使用濃度分別為 0、2.5、5.0、10.0μg/mL。

1.2 小鼠體內抗腫瘤實驗

清潔級 ICR小鼠共 50只,雌雄各半,體重 19～21 g,由云南白藥股份集團有限公司提供 (滇實動證2002106,編號 0000057)。將小鼠隨機分為 5組,分別為陰性對照組、陽性對照組、滇姜花素 A組、姜花酮組和滇姜花粗提物組,每組 10只小鼠,雌雄各半。小鼠在適應性喂養 2 d后,于右前肢皮下接種新鮮的 H22腫瘤細胞懸液 (0.1 mL/鼠,1×106細胞), H22細胞株由云南省腫瘤研究所提供。在接種腫瘤細胞后的第 2日開始按分組給藥。陰性對照組腹腔注射給予DMSO,陽性對照組給予環磷酰胺,其它各組給予相應的待測物。每天給藥 1次,于給藥的第7 d將動物脫臼處死,完整剝離腫瘤并在電子稱稱腫瘤重量及腫瘤剝離后的動物體重。比較分析各組腫瘤重量及瘤重抑制率。

瘤重抑制率 (%)=(陰性對照組腫瘤平均重量 /g-樣品組腫瘤平均重量 /g)/陰性對照組平均腫瘤重量/g×100%

1.3 體外抗腫瘤活性

MDA-MB-231是美國國立癌癥研究所推薦的抗腫瘤藥物篩選的癌細胞株之一,是雌激素受體陰性的人類乳腺癌細胞株,是乳腺癌研究中常用細胞株,并能在裸鼠體內進行普通接種。本次采用 MDAMB-231進行實驗,不僅能觀察體外抗癌效果,并能為以后的裸鼠體內抗癌實驗提供參考依據。MDAMB-231細胞株由美國 ATCC公司提供。將培養的腫瘤細胞接種于 6孔板,于 37℃、5%CO2培養箱培養 24 h后,吸去培養液,用 PBS洗一遍,再加入含有不同濃度待測物滇姜花素 C的培養液,每個劑量同時做 3孔平行檢測。加樣培養 72 h后收集細胞,于顯微鏡下計數癌細胞數,統計分析結果并繪制細胞增殖抑制曲線。

細胞增殖抑制率 (%)=(陰性對照組細胞數-待測物組細胞數)/陰性對照組細胞數 ×100%

1.4 統計方法

小鼠的體重、瘤重和體外癌細胞均數采用 t檢驗進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 滇姜花粗提物、滇姜花素 A及姜花酮對小鼠體內 H22腫瘤生長的抑制活性

體內抗腫瘤實驗研究結果見表 1。

表 1 體內抗腫瘤實驗研究結果Table 1 Result of thein vivoanticancer activity

腫瘤生長研究結果表明,滇姜花粗提物、滇姜花素A和姜花酮均顯示了明顯的體內抑瘤活性,其中滇姜花素A、姜花粗提物的體內抑瘤活性很強,腫瘤生長抑制率超過了環磷酰胺陽性對照組,姜花酮的抑瘤活性最低。

表 1結果還顯示,三個給藥組動物體重增長緩慢,盡管結果比較未發現各組之間體重有顯著性差異,但各給藥組動物的平均體重都低于陰性對照組,說明滇姜花粗提物、滇姜花素 A和姜花酮在本研究的使用劑量下可能有一定毒性。

2.2 滇姜花素 C對人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231的體外細胞毒活性

滇姜花素C對人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞的體外細胞毒活性,結果見表 2和圖 2。

表 2 滇姜花素 C對MDA-MB-231乳腺癌細胞株的抑制率Table 2 Inhibitory rate of yunnancoronarin C against human breast cancer cell lineMDA-MB-231in vitro

圖 2 滇姜花素 C對MDA-MB-231乳腺癌細胞株的抑制率曲線Fig.2 Inhibitory curve of yunnancoronarin C against human breast cancer cell lineMDA-MB-231in vitro

結果表明,滇姜花素 C對MDA-MB-231乳腺癌細胞株具有很較強的抑制作用,并具有很好的劑量反應關系,其 IC50＜5μg/mL。在劑量為 10μg/mL時,抑制率可達 100%。該實驗結果具有較好的重現性。

3 討論

滇姜花 (Hedychium yunnanense Gangep.)為姜花屬植物,主產于云南。滇姜花中含量最高的二萜成分為姜花酮 (hedychenone,1)與滇姜花素 A(yunnancoronarin A,2),在過去的研究工作中,這兩個二萜成分均具有體外抗腫瘤活性。本次研究結果表明,滇姜花素A、滇姜花的粗提物和姜花酮對小鼠體內移植性腫瘤均具有顯著的抗腫瘤活性,其中以滇姜花素A的作用最強。體外的抗腫瘤實驗結果顯示,滇姜花素 C對人類的腫瘤細胞株具有較強的細胞毒作用,與前期的體外細胞毒作用研究[4]一致。已經取得的研究結果表明,滇姜花中的二萜成分在體內體外對動物腫瘤細胞株和人類腫瘤細胞株均有很好的抗腫瘤活性,值得作為抗腫瘤藥物進行進一步研究。

本次在動物體內抗腫瘤實驗中也發現,滇姜花提取物對動物的體重生長有明顯影響,在本次實驗劑量下,實驗組動物體重生長緩慢且出現了一定的毒性反應。因此,在今后的研究中,應該對其進行安全性毒理學評價,了解其毒性作用。滇姜花的二萜成分的體內體外抗腫瘤作用機制將在今后的研究中進行探討。

1 Itokawa H,Morita H,Katou I,et al.Cytotoxic diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium.Planta M edica, 1988,54:311-315.

2 Zhao Q(趙慶),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陳耀祖),et al.Studies on diterpenoid constituents of Hedychium yunnanense.Chem J Chin Univ(高等學校化學學報),1995, 16:64-68.

3 Zhao Q(趙慶),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陳耀祖),et al.Studies on diterpenoids fromHedychium forrestiiand their antitumor activity.Acta Phar m Sinica(藥學學報),1995, 30:119-122.

4 Zhao Q(趙慶),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陳耀祖),et al.Antitumor diterpenoids fromHedychium yunnanenseand their photosensitized oxidation.Acta Botanica Sinica(植物學報),1999,41:528-530.

5 Zhao Q(趙慶),Hao XJ(郝小江),Zou C(鄒澄),et al.Two new components fromHedychium yunnanense.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),2008,20:761-764.

6 Zhao Q(趙慶),Qing C(卿晨),Hao XJ(郝小江),et al. Cytotoxicity of labdane-type diterpenoids fromHedychium forrestii.Chem Phar m Bull,2008,56:210-212.

7 Zhao Q(趙慶),Hao XJ(郝小江),Zou C(鄒澄),et al. Norditerpenoids fromHedychium villosum.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),2009,21:10-12.

Anticancer Effect of D iterpenes from Hedychium yunnanense

ZHAO Qing1,2,HE Xiao-qiong3,HAO Xiao-jiang2,ZOU Cheng3＊

1Faculty of Phar macy,Yunnan Traditional ChineseM edical College,Kunm ing 650200,China;2State Key Laboratory of Phytochem istry and Plant Resources in W est China,Kunm ing Institute of Botany,Chinese Academ y of Sciences, Kunm ing 650204,China;3School of Phar maceutical Sciences,Kunm ing M edical University,Kunm ing 650031,China

Thein vivoanticancer activity of yunnancoronarin A(1),hecychenone(2),and crude extract of hedychium yunnanense was tested here.Result revealed that yunnancoronarin A,hecychenone and the crude extractl showed significant inhibitory effecton H22 tumor in ICR mice.YunnancoronarinA had the strongest inhibitory effect,with the inhibitory ratio of 54.27%.Yunnancoronarin C(3)also showed strong anticancer effecton human breast cancer cell lineMDAMB-231 in vitro.

Hedychium yunnanense;yunnancoronarin A;yunnancoronarin C;hedychenone;anticancer activity

?

R285;Q946

A

1001-6880(2010)03-0395-03

2009-04-02 接受日期:2009-07-31

云南中醫學院科學研究基金項目 (2007年重點項目);云南省應用基礎研究計劃面上項目(2006C0045)

＊通訊作者 Tel:86-871-5729436;E-mail:qingzhaoyn2008@126.com