高效液相色譜法測定雷帕霉含量

齊 利 河南省安陽市食品藥品檢驗所（455000）

高效液相色譜法測定雷帕霉含量

齊 利 河南省安陽市食品藥品檢驗所（455000）

詳述了一種建立高效液相色譜法測定局部組織中雷帕霉素含量的實驗方法，該方法操作簡單，重現性好，為進一步研究局部應用雷帕霉素抑制血管再狹窄提供保障。

高效液相色譜法；雷帕霉素；藥物含量

雷帕霉素是一種內酯類抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管內膜增生的作用。雷帕霉素涂層支架技術在預防介入治療后冠脈再狹窄上已取得了明顯的效果；并且，也有研究發現血管周圍局部應用雷帕霉素也能抑制冠脈搭橋術后橋靜脈的再狹窄。以上均為藥物的局部應用。且已成為目前的研究熱點。本實驗擬在建立高效液相色譜法測定局部組織中雷帕霉素含量的方法，用于研究其局部藥代動力學。

1 試劑儀器與實驗動物

1.1 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜系統(美國)：三元梯度，微量標準自動進樣器，紫外一可見監測器，柱溫樣品溫控：Startorious1712型電子天平(德國)；XW一80A渦旋混合器；TGL-16B臺式離心機。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純；硫酸鋅、丙酮、乙醚、正己烷為分析純；水為超純水。雷帕霉素對照品（純度：99.4%，高效液相色譜法測定）。

1.3 動物普通級封閉群 大耳白兔，體重2.5～3.0kg。

1.4 方法與結果

1.4.1 色譜條件色譜柱 為Alltech C18(250mm×4.6mm，5μ m)，預柱：Alltech C18(7.5mm×4.6mm，5μm)。流動相為乙腈：四氫呋喃：水(55:5:40)；檢測波長：278nm，流速為1.2ml/min，柱溫60℃。

1.4.2 標準曲線的繪制 取兔正常頸外靜脈、組織勻漿，方法同上。分裝于EP管中，置-20℃冰箱中。空白血管樣本勻漿液保存備用。分別配制雷帕霉素溶液6.4、3.2、1.6、0.8～0.4、0.2ug/ml，各取10ul于離心管中分別加人空白m管樣本勻漿液0.5ml，充分混勻后，構成標準組織濃度為128、64、32、16、8、4ng/ml。22℃水浴5min，用N2吹干醚層，加150ul流動相于試管中，密塞，渦旋混勻15min，加500ul正己烷于試管中，渦旋混勻30s.8000xg離心10min，吸棄上層正己烷，下層溶液置22℃水浴中，用N2吹去殘留的正己烷及部分丙酮，至總容量為2ml，取100ul進樣測定。

1.4.3 樣品溶液的制備 手術取兔的一側頸外靜脈，長約3cm，于其周圍涂布攜0.3mg雷帕霉素的Pluronic F-127凝膠。術后1、2、4、8周取材。去除3cm血管的兩端，取其中段，收集標本。剝除血管周圍脂肪組織，生理鹽水沖洗至無殘留血液，濾紙吸干表面液體。稱重2g，眼科剪剪碎，加人1ml丙酮予以勻漿。勻漿液3500xg離心10min，按1.4.2項操作后，進樣100ul作高效液相色譜法分析。

2 結果

2.1 色譜條件及方式 本色譜條件下，樣品檢測均未發現有對雷帕霉素的干擾峰。以雷帕霉素峰面積A為縱坐標，藥物濃度C為橫坐標進行線性回歸。回歸方程為：A=3.2481C+7.4082× 10-3,r=0.9925。在4～128ng/ml范圍內線性良好。

2.2 精密度試驗 吸取同一對照品溶液，在上述色譜條件下重復進樣5次，記錄色譜峰面積，雷帕霉素峰面積RSD值為0.54%。

2.3 重復性試驗 精密稱取雷帕霉素5份，每份1mg，制備樣品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜法分析，雷帕霉素含量RSD為1.9%。

2.4 樣品測定 據回歸方程，計算出藥物濃度(表1)。可見血管外涂攜雷帕霉素的Pluronic F-127凝膠，血管組織內藥物含量隨時間遞減，但在8周內仍可有一定劑量的藥物殘留。

表1 血管組織內藥物含量

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 筆者多次對不同的色譜柱進行試驗，發現色譜柱Alltech C18(250mm×4.6mm，5μm)對雷帕霉素藥物濃度檢測的靈敏度較高，波形較好，故選擇此柱。同時，考慮到生物組織勻漿樣品中雜質較多，為延長色譜柱的使用壽命，使用了預柱AIItech C18 (7.5mm×4.6mm。5μm)。

3.2 檢測波長的選擇 將配制的雷帕霉素溶液，用紫外波長190～400nm掃描，發現雷帕霉素在278nm時有最大的吸收峰。故選擇265nm作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 在對流動相體系進行摸索的過程中，發現流動相中有機溶劑的比例對分析結果有的影響。選擇乙腈：四氫呋喃：水（55:5:40）為流動相，雜質峰對樣品峰干擾小，保留時間適宜。

3.4 流速和柱溫的選擇 流速和柱溫影響著雷帕霉素的洗脫開寸間及波形，較高的流速和較高的柱溫可以使洗脫時問更短波形較好。但過高的流速會增加整個色譜系統的壓力，過高的溫度會損壞色譜柱及其它關鍵元器件。經過摸索，選擇流速1.2ml/min，柱溫60℃。

3.5 樣品的預處理 雷帕霉素的血藥濃度的高效液相色譜法檢測已經有了比較成熟的方法 。在對血管的預處理時。筆者在血樣預處理方法的基礎上加入了切碎和勻漿，并在勻漿中加人了1ml丙酮，以加大對血管壁內雷帕霉素的回收。結果表明：檢測方法滿意。

本法操作簡單，重現性好，可用于測定局部血管組織中雷帕霉素含量，研究其藥代動力學和組織分布,為進一步研究局部應用雷帕霉素抑制血管再狹窄提供保障。

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.174

1672-2779（2010）-18-0238-02

2010-06-15）