膿毒癥大鼠肌肉惡病質發生機制的實驗研究

劉敏豐,高志光,秦環龍

(1.江蘇省無錫市第三人民醫院消化科,江蘇無錫,214041;2.上海交通大學附屬第六人民醫院,上海,200233)

在膿毒癥、嚴重創傷、燒傷和外科大手術后,機體以明顯的代謝紊亂為特征,表現為糖和脂的利用障礙,而蛋白則處于高分解代謝狀態,骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎縮,疲乏無力,這種現象稱之為肌肉惡病質。當前對于感染后肌肉降解的分子機制并不明確,本文探討膿毒癥時肌肉惡病質發生的分子機制,為臨床治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

雄性SD大鼠20只(復旦大學醫學院動物中心提供,清潔級),體重250～320 g。隨機分為2組:正常組和膿毒癥組,每組10只。采用盲腸結扎穿孔法1(CLP)建立膿毒癥動物模型。正常鼠食喂養5天,在氯胺酮腹腔注射麻醉(40 mg/kg)下,分別采集門靜脈血和趾長伸肌組織行相應指標檢測。

1.2 主要實驗試劑和儀器

①氨基酸標準品,Sigma公司;②兔抗大鼠泛素多抗體,美國Dako公司;③Envision試劑,美國Dako公司;④大鼠TNF-α、IL-1、IL-6、皮質醇試劑盒(ELISA法),美國DSL公司;⑤Agi-Lent高效液相色譜儀;⑥醫學圖像分析軟件,上海申騰信息技術有限公司;⑦iCycLer定量PCR儀,美國 Bio-Rad公司;⑧DNA thermaL CycLer 480 PCR 儀,美國Perkin EmLer公司 。

1.3 實驗方法

血清細胞因子和皮質醇濃度測定:①于術后第6天,大鼠在腹腔麻醉下,打開腹腔,取門靜脈血1 mL,離心(2 000 rpm,5 min),取血清,備用;②采用雙抗夾心ELISA法,根據相應試劑盒操作步驟,分別對標準品和血清樣品進行反應;③根據標準品檢測結果繪制標準曲線;④根據標準曲線查出待測樣品濃度。

高效液相色譜-熒光檢測法檢測趾長伸肌組織內三甲基組氨酸(3-MH)濃度:①無菌、快速分離大鼠趾長伸肌稱重后,高速勻漿并離心,吸取上清液,待用;②配制氨基酸標準液,終濃度250 pmoL/μ L;③柱前衍生;④色譜條件:流動相采用10 mmoL/L磷酸鈉緩沖液(含30%乙腈,pH 7.50),等度洗脫,流速1.0 mL/min;進樣量100 μ L;柱溫:室溫;熒光檢測波長:激發365 nm,發射460 nm;⑤利用3-MH標準品制備標準曲線;⑥根據標準曲線定量。

電鏡觀察骨骼肌纖維超微結構:活體快速采取大鼠趾長伸肌組織,用刀片修整成1 mm 3小塊后,2.5%戊二醛固定,放置4℃冰箱保存。統一脫水后用環氧樹脂618包埋,超薄制片,定位,醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察骨骼肌纖維大體形態和胞質內細胞器改變。

免疫組化檢測骨骼肌泛素蛋白:①取大鼠趾長伸肌組織,常規福爾馬林固定,脫水,透明,石蠟包埋和切片,采用Envision兩步免疫組化法檢測泛素蛋白水平表達。②結果觀察:OLYMPUS BH2顯微鏡,陽性產物為棕黃色或棕褐色,并呈顆粒狀,背景為藍色;③數碼拍照后計算機圖像處理:數碼照片使用 PANASONIC MV-CP410相機拍攝;采用IMS細胞圖像分析系統,醫學圖像分析軟件,在相同放大倍數(200)下,于各組切片中隨機選取9個視野,計算平均陽性指數,陽性指數=每視野顯色陽性面積×每視野光密度值(OD)。

實時熒光定量PCR(reaL-time qPCR)檢測大鼠骨骼肌泛素mRNA:①引物和探針見表1;②取大鼠趾長伸肌組織,放入研缽中加液氮研磨成粉末;③利用 TrizoL試劑盒一步法提取總RNA;④逆轉錄;⑤相同條件下分別對標準品PGEMT質粒和待測樣品進行實時熒光qPCR;⑥根據標準品的已知濃度和結果繪制標準曲線;⑦根據標準曲線,分別算出樣本的檢測指標和標準品的濃度,然后計算各樣本的檢測指標與對應的標準品的濃度的比值作為結果。

表1 引物和Taqman探針

2 結 果

體重變化:實驗前后,膿毒癥組大鼠體重明顯下降(43.5±5.80 g)。

血清細胞因子和皮質醇濃度:與正常組相比,膿毒癥組大鼠血清細胞因子和皮質醇濃度均明顯升高(P<0.01),見表2。

表2 血清細胞因子和皮質醇濃度

趾長伸肌組織3-MH濃度:膿毒癥組大鼠3-MH濃度(8.85±0.30 nmoL/g)明顯高于正常組(4.53±0.18 nmoL/g),差異有明顯統計學意義(P<0.01)。

電鏡骨骼肌纖維形態學檢測:透視電鏡下觀察可見正常對照組大鼠趾長伸肌肌小節完整,肌絲排列整齊,線粒體呈桿狀,嵴完整。膿毒癥組大鼠趾長伸肌鏡下可見肌原纖維排列松散,線粒體腫脹、破裂,部分肌小節肌絲溶解。

骨骼肌泛素蛋白表達:免疫組化圖像和圖像分析結果顯示,與正常組相比,膿毒癥組大鼠趾長伸肌組織泛素蛋白表達明顯增強(P<0.01),見表3。

表3 圖像分析結果

骨骼肌泛素mRNA表達:膿毒癥組大鼠趾長伸肌組織泛素mRNA表達(0.426±0.042)明顯高于正常組(0.112±0.014),差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

在膿毒癥、嚴重創傷、燒傷和外科大手術后,機體以明顯的代謝紊亂為特征,表現為糖和脂的利用障礙,而蛋白則處于高分解代謝狀態,骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎縮,疲乏無力,這種現象稱之為肌肉惡病質。由于肌肉是機體最大的蛋白質儲存庫,肌肉蛋白的消耗將占據機體蛋白丟失的重要部分,持續而嚴重的肌肉消耗會導致明顯的肌原纖維水解增加,引起肌肉萎縮和耗竭,不利于患者的疾病恢復,如累及呼吸肌,持續的人工呼吸支持又會增加相關的呼吸道并發癥[1-2],從而增加外科危重患者的死亡率。

不同原因致臨床肌肉惡病質發生的細胞內機制和分子調節機制基本類似。其中蛋白合成減少和氨基酸攝入減少雖然也是造成骨骼肌代謝反應異常的原因,但蛋白降解增加,尤其是肌原纖維蛋白質中的肌動蛋白和肌球蛋白的降解增加是導致肌肉惡病質的最重要原因。而泛素-蛋白酶體途徑在多種蛋白質的降解過程中發揮著重要作用,而且具有高度的特異性。越來越多的研究發現,由各種原因如膿毒癥、燒傷、腎衰竭以及腫瘤等所引起的骨骼肌代謝障礙中,泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白質降解起著不容忽視的主導作用。

泛素是含有76個氨基酸殘基的多肽,分子量約8.5 ku,屬高度保守蛋白。1975年首先從小牛的胰腺中分離出來,因廣泛存在于各種真核細胞和組織中而得名。

膿毒癥時骨骼肌蛋白的降解增加是由泛素-蛋白酶體途徑被激活而造成的。1994年,Tiao等[3]通過研究大鼠盲腸結扎穿孔模型研究了不同細胞內蛋白水解通路在膿毒癥時骨骼肌蛋白降解中的作用,發現溶酶體途徑和鈣/鈣激活蛋白酶途徑介導的蛋白水解在正常組和膿毒癥組差異不大,而泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白水解在膿毒癥組的總體蛋白降解和肌纖維蛋白降解分別增加172%和440%,膿毒癥組大鼠泛素mRNA也相應增加了數倍,結果顯示膿毒癥骨骼肌蛋白降解中起主導地位的是泛素-蛋白酶體途徑。而國內柴家科等[4]也研究發現,膿毒癥大鼠骨骼肌組織中的泛素和泛素化蛋白的表達明顯上調,而且與肌纖維蛋白降解率在時相上呈協同增強作用。

一些細胞因子和糖皮質激素是膿毒癥肌肉惡病質時最重要的調節因子,有研究發現膿毒癥大鼠血漿中糖皮質激素水平顯著增高[5];實驗大鼠給予地塞米松后伸趾長肌蛋白分解率顯著升高,且呈量-效關系[6];另有報道由膿毒癥或外傷誘導產生的肌肉降解可以通過給予糖皮質激素受體阻滯劑RU38486得以減輕[7]。一般認為糖皮質激素是通過激活泛素-蛋白酶體途徑而促進肌蛋白降解的。細胞因子對肌肉惡病質的調節機制目前尚不明了,但多數學者還是肯定了其與肌肉惡病質的關系。與肌蛋白降解有關的細胞因子主要有TNF、IL-1和IL-6。有研究認為,這些細胞因子能直接增強骨骼肌局部組織中溶酶體內不同組織蛋白酶的活性而導致其蛋白質分解代謝增強。也有研究表明這些細胞因子通過激活肌組織中的泛素-蛋白酶體活性來增強其降解而起間接作用。應用細胞因子的拮抗劑如己酮可可堿和蘇拉明可以明顯降低泛素-蛋白酶體途徑和鈣/鈣激活蛋白酶途徑的活性,減少肌蛋白的降解[8]。

本實驗對膿毒癥骨骼肌降解發生機制進行了初步研究,通過免疫組化和reaL-time qPCR分別檢測大鼠趾長伸肌組織泛素蛋白和泛素mRNA表達,利用電鏡技術觀察骨骼肌纖維超微結構變化,采用高效液相色譜-熒光法檢測趾長伸肌組織內3-MH濃度,3-MH是一種只存在于肌肉肌動蛋白和肌凝蛋白的氨基酸,由于分解代謝時釋放產生的3-MH不再參與骨骼肌細胞新蛋白的合成,故其釋放量可間接反映肌纖維蛋白的降解情況。結果顯示膿毒癥組大鼠骨骼肌組織內泛素蛋白和泛素mRNA表達明顯上調,而且增加明顯,電鏡下表現為分解代謝旺盛,而3-MH濃度也隨之明顯增加,提示肌纖維蛋白降解增強,同時證實骨骼肌蛋白的降解與泛素-蛋白酶體途徑關系密切,泛素-蛋白酶體途徑在膿毒癥大鼠骨骼肌降解過程中可能起著關鍵性作用。

本實驗也發現膿毒癥組大鼠血清內皮質醇、TNF-α、IL-1和IL-6濃度較正常組明顯升高,提示皮質醇、TNF-α、IL-1和 IL-6可能在膿毒癥肌肉惡病質的發生發展過程中起著直接或間接的調節作用,具體機制有待進一步探討。

[1]Steiger E.A technique for Long term intravenous feeding in unrestrained rats[J].Arch Surg,1972,104(3):330.

[2]HasseLgren,Per-OLof MD.MuscLe cachexia:current concepts of intraceLLuLar mechanisms and moLecuLar reguLation[J].Ann Surg,2001,233(1):9.

[3]Tiao G,Fagan JM,SamueLs N,et al.Sepsis stimuLates nonLysosomaL,energy-dependent proteoLysis and increases ubiquitin mRNA LeveLs in rat skeLetaL muscLe[J].J CLin Invest,1994,94:2255.

[4]柴家科,吳焱秋.膿毒癥對大鼠骨骼肌組織泛素及泛素化蛋白表達的影響[J].中華外科雜志,2001,39(9):721.

[5]柴家科,吳焱秋.膿毒癥對不同類型骨骼肌蛋白降解率的影響及其機制初探[J].中國危重病急救醫學,2001,13(5):272.

[6]申傳安,柴家科.糖皮質激素對大鼠骨骼肌蛋白分解代謝的影響及其機制探討[J].中國危重病急救醫學,2002,14(7):428.

[7]HasseLgren,-P-O.MoLecuLar reguLation of muscLe cachexia:it may be more than the proteasome[J].Biochem-Biophys-Res-Commun,2002,290(1):1.

[8]CosteLLi-P,BossoLa-M.Anticytokine treatment prevents the increase in the activity of ATP-ubiquitin-and Ca2+-dependent proteoLytic systems in the muscLe of tumour-bearing rats[J].Cytokine,2002,19(1):1.