黃瓜灰霉病拮抗放線菌的篩選

關(guān)麗杰, 楊 迪, 譚國(guó)梁

(沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110142)

黃瓜灰霉病拮抗放線菌的篩選

關(guān)麗杰, 楊 迪, 譚國(guó)梁

(沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110142)

從遼寧、北京等不同地區(qū)采集土壤樣品 25份,采用平板稀釋分離法得到放線菌,通過(guò)抑菌圈法篩選獲得對(duì)黃瓜灰霉病病原菌 (Botrytis cinereaPers.)有抑制作用的拮抗放線菌.采用牛津杯法對(duì) 28株拮抗菌發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩,抑菌圈直徑≥15 mm的拮抗菌有 16株,其中 4株抑制作用明顯,抑菌直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

灰葡萄孢菌; 拮抗菌; 篩選

由灰葡萄孢菌 (Botrytis cinereaPers.)引起的植物灰霉病目前已成為茄果類(lèi)、瓜類(lèi)、蔥韭類(lèi)、漿果類(lèi)等多種果蔬作物生產(chǎn)的主要限制因素[1].20世紀(jì) 70年代以來(lái),相繼采用多種化學(xué)殺菌劑控制此病的危害,但由于該病原菌遺傳變異大,適應(yīng)性強(qiáng),已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性[2-4].

放線菌作為一種具有豐富資源的微生物類(lèi)群,其產(chǎn)生的抗生素及其他次生代謝物質(zhì)在農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治方面具有重要作用,是具有應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類(lèi)微生物,在植物病蟲(chóng)害生物防治中具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[5-6].近 10年來(lái)從微生物中發(fā)現(xiàn)的新活性物質(zhì) 902個(gè),其中放線菌產(chǎn)生的有 668個(gè),占 74%.不僅如此,放線菌還產(chǎn)生其他各種工農(nóng)業(yè)有用的產(chǎn)品,如醇制劑等.此外,放線菌還可以合成淀粉酶、纖維素酶、氨基酸及維生素等多種有用的代謝產(chǎn)物.

利用放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行植物病原真菌病害的生物防治,具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)[7-8].放線菌作為最早應(yīng)用到生物防治中的微生物,由于其有很強(qiáng)的分解纖維素、石蠟、瓊脂、角蛋白和橡膠等復(fù)雜有機(jī)物的能力,故它們?cè)谧匀唤缥镔|(zhì)循環(huán)和提高土壤肥力等方面有著重要的作用.隨著科技的發(fā)展,拮抗放線菌必將會(huì)廣泛應(yīng)用于微生物農(nóng)藥的研制和生產(chǎn).我國(guó)幅員遼闊,地形、氣候復(fù)雜,生態(tài)多樣,放線菌的種類(lèi)與資源比其他國(guó)家更非富,亟待深入研究與開(kāi)發(fā).本文通過(guò)抑菌圈法從土壤樣品中篩選得到了對(duì)黃瓜灰霉病病菌有強(qiáng)烈抑制作用的放線菌菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣來(lái)源

從遼寧、北京、河北、黑龍江、內(nèi)蒙古等省蔬菜地、森林土壤中隨機(jī)采集土樣 25份.

1.1.2 供試菌種

黃瓜灰霉病病菌 (B otrytis cinereaPers.),由沈陽(yáng)化工大學(xué)生物工程教研室分離并保存.

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

培養(yǎng)基 1:淀粉 4.7 g,花生粉 2.2 g,酵母粉0.2 g,(NH4)2SO40.27 g,CaCO30.27 g,NaCl 0.27 g,pH=7.2.

培養(yǎng)基 2:淀粉 4.7 g,(NH4)2SO40.4 g,花生餅粉 3.3 g,CaCO30.4 g,NaCl 0.4 g,pH=7.0.

培養(yǎng)基 3:花生餅粉 2.5 g,淀粉 5.0 g,酵母粉 0.08 g,葡萄糖 0.02 g,(NH4)2SO40.08 g, CaCO30.32 g,NaCl 0.2 g,pH=7.0～7.2.

培養(yǎng)基 4:黃豆餅粉 3 g,玉米粉 2 g,葡萄糖2 g,(NH4)2SO40.4 g,CaCO30.4 g,K2HPO40.02 g,pH=7.0～7.2.

培養(yǎng)基 5:葡萄糖 3 g,玉米面 3 g,黃豆餅粉3 g,(NH4)2SO40.4 g,MgSO40.04 g,酵母膏 0.4 g,pH=7.0～7.2.

培養(yǎng)基 6:麩皮 1 g,淀粉 1.33 g,葡萄糖 0.67 g,NaCl 0.05 g,MgSO40.05 g,K2HPO40.05 g,Fe-SO40.005 g,KNO30.1 g,pH=7.2～7.4.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌的分離與純化

采用稀釋分離法處理采集的土壤樣品.培養(yǎng)基為高氏 1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基.具體操作如下:

稱(chēng)取研細(xì)的分離土樣 5 g,加入盛有 45 mL滅菌水的三角瓶中,充分振蕩 10 min,吸取 1 mL混懸液,用無(wú)菌水梯度稀釋.選擇 10-3、10-4和10-5三個(gè)濃度的懸浮液 0.1 mL放到培養(yǎng)基上,用涂布棒涂勻,然后將培養(yǎng)皿倒置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4～10 d,每天進(jìn)行觀察并挑選菌落形態(tài)各不相同的菌株及時(shí)轉(zhuǎn)接到斜面上培養(yǎng),并編號(hào)保存.

1.2.2 拮抗放線菌的初篩

以黃瓜灰霉病病菌為靶標(biāo),采取抑菌圈法進(jìn)行拮抗放線菌篩選.

將活化的黃瓜灰霉病菌制成孢子懸液 (光學(xué)顯微鏡 20×40倍下,80個(gè)/視野),吸取 15 mL加入 250 mL熔融態(tài) PDA培養(yǎng)基,制成混菌平板,等距離放置直徑 7 mm的放線菌菌塊,28℃恒溫培養(yǎng) 4 d后十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑.抑菌圈直徑≥15 mm的菌株進(jìn)入復(fù)篩.

1.2.3 拮抗放線菌的復(fù)篩

復(fù)篩采用牛津杯法.混菌平板上等距離放置無(wú)菌牛津杯,加樣量 200μL,28℃恒溫培養(yǎng) 3 d,十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑.抑菌圈直徑≥15 mm菌株重復(fù)發(fā)酵,測(cè)定抑菌效果.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離與純化

從遼寧、北京、河北、黑龍江、內(nèi)蒙古等省蔬菜地、森林土壤中隨機(jī)采集土樣 25份,采用稀釋分離法得到放線菌 521株.將這些菌株在高氏一號(hào)斜面上培養(yǎng),4℃保存,備用.

2.2 拮抗放線菌的初篩

活體抑菌實(shí)驗(yàn)表明,抑菌圈直徑≥15 mm的菌株共有 28株 (見(jiàn)表 1).

表 1 放線菌活體對(duì)黃瓜灰霉病的抑菌活性Table 1 Inhibition of antagonisisticactinom ycetestoBotrytis cinerea

2.3 拮抗放線菌的復(fù)篩

28個(gè)菌株經(jīng) 6種不同培養(yǎng)基發(fā)酵后,抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:有 16株菌在其合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵后,發(fā)酵液有明顯的抑菌活性,抑菌圈直徑≥15 mm,且清晰透明(見(jiàn)表 2,圖 1).

表2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌活性Table 2 The inhibition effect of the fermented broth from the different cultured media againstBotrytis cinerea

圖 1 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病病菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of the fermented broth againstBotrytis cinerea

其中菌株 7-16、7-29、13-25和 7-37的發(fā)酵液抑菌活性較高,抑菌直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑菌圈法從 521株放線菌中初篩得到對(duì)黃瓜灰霉病有拮抗作用的菌株 28株;采用牛津杯法對(duì) 28株拮抗放線菌株的 6種不同培養(yǎng)基發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩,16株拮抗菌的發(fā)酵液對(duì)病原菌有抑制作用,其中 4株抑制作用明顯,其抑菌圈直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和57.9 mm.其抑菌圈直徑均大于 57 mm,這將為今后黃瓜灰霉病生防制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

放線菌分布廣泛,形狀差別大,沒(méi)有普遍使用的分離方法和培養(yǎng)基,固從樣本中分離的放線菌遠(yuǎn)低于實(shí)際數(shù)量.進(jìn)行放線菌資源開(kāi)發(fā),獲得新菌種是必要條件之一,分離方法的研究顯得越發(fā)重要,尋找新思路,改進(jìn)分離篩選方法,是目前放線菌研究面臨的重大問(wèn)題之一.

[1] 楊燕濤.國(guó)內(nèi)保護(hù)地蔬菜灰霉病侵染規(guī)律及防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2003,42(l):6-10.

[2] 周明國(guó),葉鐘音,杭建勝.對(duì)多菌靈具有抗性的草葛灰霉病菌菌株形成與分布研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1990,13(3):57-60.

[3] 丁中,劉峰,王會(huì)利,等.番茄灰霉菌的多重抗藥性研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,32(4):452-456.

[4] 紀(jì)明山,祁之秋,趙平,等.番茄灰霉病菌對(duì)崛霉胺抗藥性的試驗(yàn) [J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33 (5):345-347.

[5] Forster S M.O rangic Components Process[J].Soil Science,1969,33:420-423.

[6] V an A rsdall R T,Frantz C.Potential Role of Farm er Cooperatives in Reducing Pest Risk:Final Report [EB/OL].(2001)[2009-12-7].http://www. pesp.org/2000/ncfcooifinal.htm.

[7] CoyierD L,Covey R P.Tolerance of Erw inia Am ylovora to Streptom ycin Sulfate in O regon andwashington[J].Plant D is.Rep.,1975,59:849-852.

[8] 黃昌華,郭崇明.B-HCH菌株發(fā)酵濾液對(duì)植物病原真菌的作用 [J].中國(guó)生物防治,1996,12(3): 107-109.

Screening ofAntagonistic Actinomyces againstBotrytis Cinerea Pers.

GUAN L i-jie, YANG D i, TAN Guo-liang
(Shenyang U niversity of Chem ical Technology,Shenyang110142,China)

Streptomyces strains w ere isolated from25soil samples collected from L iaoning.U sing zone of inhibition as the screening m ethod,Streptom yces strains that had inhibition of antagonistic actinom ycetes on Botrytis cinerea w ere obtained.O xford cup m ethod was adopted to re-screen28Streptom yces strains.16Streptm yces strains had diam eter of inhibition zone≥15mm.4antagonisistic actinom ycetes had m ore inhibition,and their diam eter of inhibition zone w ere:60.2mm,59.6mm,58.7mm and57.9mm, respectively.

Botrytis cinerea Pers.; antagonistic actinom yces; screening

Q815

A

1004-4639(2010)03-0219-03

2009-12-05

關(guān)麗杰(1968-),滿(mǎn)族,女,遼寧沈陽(yáng)人,副教授,博士,主要從事植物保護(hù)產(chǎn)品與安全評(píng)價(jià)以及植物病理學(xué)方面的研究.