龍須菜多糖硫酸化對免疫活性的影響

陳美珍，余 杰，楊拉維，潘群文

(汕頭大學理學院生物系，廣東 汕頭 515063)

龍須菜多糖硫酸化對免疫活性的影響

陳美珍，余 杰，楊拉維，潘群文

(汕頭大學理學院生物系，廣東 汕頭 515063)

分別采用改良的氯磺酸-吡啶法和HCl-甲醇法對龍須菜多糖進行硫酸化修飾與脫硫處理，探討不同硫酸基含量的天然多糖、硫酸化多糖和脫硫多糖對由環磷酰胺引起的免疫力低下小鼠免疫功能的影響。結果表明：與模型組比較，天然多糖對提高小鼠的脾臟指數(P＜0.05)、巨噬細胞的吞噬活性(P＜0.05)、脾細胞增殖轉化能力(P＜0.05)、NK細胞殺傷活性(P＜0.01)等作用最強，其次是硫酸化多糖，而脫硫多糖作用最弱；這3種多糖都能顯著促進免疫抑制小鼠的溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)，其中天然多糖和硫酸化多糖優于脫硫多糖。顯示龍須菜多糖能顯著提高免疫力低下小鼠的免疫功能，但多糖中硫酸基含量與免疫作用非線性關系，增加或脫除天然多糖硫酸基其免疫活性均下降，尤其是脫除硫酸基后免疫活性顯著降低。

龍須菜多糖；硫酸基；免疫活性

Abstract：Improved chlorosulfonic acid/pyridine and HCl/methyl alcohol methods were used for sulfurizing and desulfurizing native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides, respectively. The immunoregulatory effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides in mice with low immunity induced by cyclophosphamide were investigated.Compared with the model group, native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides were the most effective in improving spleen index (P＜0.05), phagocytic activity of macrophages (P＜0.05), proliferation and transformation of spleen cells (P＜0.05) and NK cell killing activity (P＜0.01), followed by sulfurized and desulfurized ones. All three polysaccharides could significantly improve the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (P ＜ 0.01), native and sulfurized Gracilaria lemaneiformis polysaccharides were superior to desulfurized ones. Based on these results, it can be concluded that Gracilaria lemaneiformis polysaccharides significantly increase the immune function in immunocompromised mice, that sulfate content in Gracilaria lemaneiformis polysaccharides is nonlinearly related to their immunoregulatory effect in immunocompromised mice, and that both sulfurization and desulfurization decrease the immunoregulatory effect of native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides, especially desulfurization resulted in a significant decrease.

Key words：polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis；sulfate；immunocompetence

龍須菜(Gracilaria lemaneiformis) 隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、紅藻綱(Rhodophyceae)、真紅藻亞綱(Florideae)、杉藻目(Gigartinales) 、江蘺科(Gracilariaceae)江蘺屬(Gracilaria) 紅藻。目前，龍須菜在我國已經成為繼海帶、紫菜、裙帶菜之后的第四大栽培海藻，資源日益豐富[1]。龍須菜含有占干質量31.05%的硫酸多糖[2]，其具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和增強免疫力等多種生理活性[3-6]，具有很好的研究開發利用價值。大量的研究表明，藻類多糖的生理活性主要受多糖相對分子質量、硫酸基含量以及多糖的空間構象的影響[7-8]。對大多數硫酸化多糖而言，若將硫酸基去除，則其活性降低或消失(尤其是抗病毒活性)[9-10]。

研究發現龍須菜多糖的抗病毒活性與其硫酸基含量有關[4]；龍須菜多糖經脫硫酸作用后，硫酸基含量下降，其免疫活性相應降低[11]。為了進一步揭示龍須菜多糖硫酸基與其生理活性的關系，本研究在前期完成了龍須菜多糖硫酸化修飾和脫硫酸化作用的工藝條件優化的基礎上，制備不同硫酸基含量的多糖樣品，探討多糖硫酸基含量對其免疫活性的影響，以期為龍須菜多糖的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人工養殖的新鮮龍須菜，KF981品系(由汕頭大學海洋生物研究所陳偉洲高級工程師鑒定)，于2008年3月采自廣東汕頭南澳島。

龍須菜天然多糖(精多糖)、硫酸化多糖、脫硫多糖均由本實驗室制備，它們的硫酸基含量依次為：12.25%、24.67%、1.15%。多糖使用前均配成一定濃度的水溶液。

昆明種小鼠，體質量20～22g，清潔級，購于廈門大學實驗動物中心，合格證號：SCXK閩2004-0001；HeLa細胞購于中科院上海生物細胞研究所。

考馬斯亮蘭G-250 FLuka 分裝；RPMI-1640培養液、胰蛋白酶、刀豆蛋白A(ConA)、臺盼藍 Sigma公司；MTT Sangon公司；氯化鈉注射液 福州海王福藥制藥有限公司；注射用環磷酰胺(CTX) 上海華聯制藥有限公司；豚鼠血清 上海晶天生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)；三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、四乙氧基丙烷(TEP)等均為國產分析純；雞紅細胞 自制。

1.2 儀器與設備

CT5DL型日立離心機 Tokyo公司；N-1001S-WA旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；Savant Modulyod冷凍干燥機 Termo公司；SS-325全自動滅菌柜 Tomy公司；UV mini-1240紫外可見分光光度計 島津公司；Thermo Labsystems酶標儀 Thermo公司；CO2培養箱SheL Lab公司；超凈工作臺 Air Tech公司；96孔細胞培養板 G＆H公司；倒置顯微鏡 Olympus公司；FTIR Avatar 360紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 不同硫酸基含量的多糖樣品制備

天然多糖：用90℃、料水比1:100(m/V)熱水提取龍須菜藻體多糖，提取液離心棄沉淀，上清液真空濃縮至1/3后用3倍量無水乙醇沉淀多糖，4℃放置過夜，離心，將沉淀物冷凍干燥，得龍須菜粗多糖。將粗多糖用水溶解，加入一定量TCA溶液(至TCA終質量濃度達到70g/100mL)，沉淀蛋白質，4℃放置過夜，離心后用質量分數10%的NaOH溶液中和糖液。然后將糖液在70～80℃溫度下減壓濃縮至一定體積后于蒸餾水中透析3d以上，低溫濃縮至一定濃度后冷凍干燥得到龍須菜天然多糖(PGL)，經測定其多糖含量為94.48%，用凱式定氮法測定其粗蛋白的含量為0.98%。

1.3.2 多糖的硫酸化修飾

采用文獻[12]改良法。將0.2g PGL粉末溶于35mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，室溫攪拌30min后，加入17.5mL硫酸化試劑(氯磺酸與吡啶的體積比為1:6)，置于60℃水浴攪拌反應3h。反應結束后冷卻至室溫，反應液加入100mL冰水，用1mol/LNaOH中和至pH7.5，減壓濃縮至一定濃度，用蒸餾水透析3d，透析液濃縮后經冷凍干燥得到硫酸化多糖。

1.3.3 多糖的脫硫

HCl-甲醇法[13-14]。取PGL1.00g，加入到100mL 0.065mol/L HCI-甲醇溶液中，將此溶液置于搖床內，轉速220r/min，溫度15℃，振蕩24h后，離心，棄上清，向不溶物中重新加入100mL新鮮的HCl-甲醇溶液，繼續振蕩24h。如上重復2～3次后，用甲醇反復洗去HCl，晾干，復溶于蒸餾水，透析48h以上，濃縮，冷凍干燥。

1.3.4 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸比色法[15]，以D - 半乳糖作標準品。

1.3.5 硫酸基含量的測定

采用硫酸鋇比濁法[15-16]，具體操作按文獻[4]的方法進行。

1.3.6 多糖樣品紅外光譜分析

用FTIR Avatar 360紅外光譜儀，KBr 壓片，在400～4000cm-1之間掃描。

1.3.7 小鼠免疫作用實驗

1.3.7.1 小鼠分組、造模、給藥及臟器指數的測定

小鼠隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，各組體質量無顯著差異，分別為對照組、模型組和3個給藥組(天然多糖、硫酸化多糖和脫硫多糖組)。對照組每天灌胃生理鹽水0.4mL和腹腔注射生理鹽水0.4mL，模型組腹腔注射CTX 20mg/(kg bw·d)和每天灌胃生理鹽水0.4mL，各給藥組分別經灌胃給予相應的多糖溶液，劑量均為100mg/(kg bw·d)，同時腹腔注射CTX 20mg/(kg bw·d)，連續7d。給藥7d后小鼠脫頸椎處死，無菌條件下剝取脾臟、胸腺器官稱質量，計算臟器指數。

1.3.7.2 腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定

按1.3.7.1節中的方法分組、造模及給藥，給藥7d后，每只小鼠腹腔注射質量分數5%的雞紅細胞生理鹽水懸液0.5mL進行免疫，以文獻[17]的方法檢測免疫小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率。按式(2)、(3)求出巨噬細胞吞噬率及吞噬指數。

1.3.7.3 脾淋巴細胞增殖活性的測定

采用MTT 法測定各組小鼠脾淋巴細胞轉化指數[18]。

按1.3.7.1節的方法分組、造模及給藥。給藥7d后各組小鼠脫頸椎處死，無菌取脾，常規制備脾細胞。將細胞溶于含有10%小牛血清的RPMI-1640培養液中，臺盼藍染色計數(活細胞數95%以上)，調整細胞濃度為2×106個/mL，加入96孔培養板中，每孔200μL，再加入5μL 200mg/L的ConA溶液，對照孔加5μL的培養基代替，均設4個復孔。置37℃、5%CO2培養箱培養72h，培養結束前4h取出，每孔吸出100μL上清液，加入20μL，5mg/mL的MTT溶液(PBS配制，過濾除菌)，繼續培養4h，離心棄上清，每孔加入150μL、37℃預溫的DMSO，振蕩10min，酶標儀測定570nm波長處的吸光度，參考波長630nm，計算淋巴細胞的增殖指數。

式中：A處理為加ConA孔吸光度；A對照為空白孔吸光度。

1.3.7.4 NK細胞殺傷活性測定

采用MTT法檢測NK細胞殺傷活性[17-18]。同1.3.7.3節中的方法分組、造模、給藥和制備脾細胞。用10%小牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度至5×107個/mL作為效應細胞。取傳代培養的HeLa細胞作為靶細胞(調整其細胞濃度為1×106個/mL)。取靶細胞懸液加入96孔板，每孔100μL，提前培養8h。然后加入100μL效應細胞，效靶比為50:1，同時設靶細胞對照孔和效應細胞對照孔，均設4個復孔。置37℃、5%CO2培養箱中培養4h，取出后吸去上清液100μL，再向每孔加入5mg/mL溶液MTT 20μL繼續孵育3h。離心棄上清，每孔加入100μL DMSO，振蕩10min，酶標儀測定570nm波長處的吸光度，參考波長630nm，計算NK細胞殺傷活性。

式中：A靶細胞為靶細胞孔吸光度；A實驗為靶細胞和效應細胞共同作用孔吸光度；A效應細胞為效應細胞孔吸光度。

1.3.7.5 溶血素及溶血空斑形成測定[17,19]

采用分光光度法，具體參照文獻[19]的方法測定。

按1.3.7.1節的方法小鼠分組、造模、給藥。給藥第1天，各組小鼠均腹腔注射20%的雞紅細胞生理鹽水混懸液0.2mL進行免疫。于第7天給藥后2h，小鼠眼眶取血，3500r/min離心10min，分離血清。血清用生理鹽水1:100 稀釋后，取1mL 稀釋液與20%的雞紅細胞混懸液0.5mL、100g/L的補體0.5mL ( 豚鼠血清，用雞紅細胞預先飽和6h) 混勻，37℃孵育30min，冰水浴中終止反應。另設不加補體的空白管作對照，吸取各管上清液于540nm波長處測吸光度，檢測溶血素形成情況。

小鼠取血致死后，解剖取出脾臟，每兩個小鼠脾臟放在一起，用勻漿器勻漿，用冷的都氏液調整脾細胞數為5×109個/mL混懸液。取脾細胞混懸液、0.2%雞紅細胞混懸液和1:10稀釋的豚鼠血清各0.5mL 混勻。另設不加補體的空白對照，37℃孵育1h，3500r/min離心10min，取上清液于413nm波長處測吸光度，檢測溶血空斑形成情況。

1.4 數據處理

數據處理采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，結果均以(±s) 表示。組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 多糖的硫酸化修飾和脫硫結果

圖1 3種多糖的紅外光譜Fig.1 IR spectra of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides

從3種多糖的IR譜圖(圖1)可以看出，天然多糖經硫酸化和脫硫處理后，雖然曲線形狀(吸收峰)有一定變化，但硫酸化和脫硫多糖的IR光譜在3400cm-1附近、在1400～1200、1200～1000cm-1處有多糖類化合物的特征性吸收峰[20]；在1074cm-1和931cm-1附近有3,6-內醚-半乳糖吸收峰[20]存在，而3,6-內醚鍵是不穩定的，可見天然多糖經硫酸化和脫硫處理后，其母體部位未改變。此外，3種多糖的IR光譜在1250cm-1附近都有一特征吸收峰，表明有硫酸基存在[20]，與天然多糖比較，硫酸化后的吸收峰顯著增強，而脫硫后的吸收峰強度降低，表明了硫酸基含量發生了明顯變化。至于天然多糖經硫酸化和脫硫處理后，多糖分子其他基團和空間構象如何變化等尚待結合其他方法進一步分析。

2.2 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響

表1 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune organ indexes in immunocompromised mice (± s，n=10)

表1 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune organ indexes in immunocompromised mice (± s，n=10)

注：*.與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)；**.與對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。△.與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)；△△.與模型組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 脾臟指數/(mg/g) 胸腺指數/(mg/g)對照組 5.986±0.717 4.155±0.063模型組 3.519±0.407** 1.711±0.146**天然多糖組 5.034±0.824△ 1.739±0.350硫酸化多糖組 3.689±0.951 2.229±0.559脫硫多糖組 3.811±0.187 2.238±0.438

由表1可見，與對照組比較，模型組小鼠脾臟和胸腺指數均顯著降低(P＜0.01)，說明成功建立免疫抑制模型。與模型組相比，各多糖組對CTX引起的脾臟和胸腺器官的萎縮具有一定的保護和修復作用，其中天然多糖對脾臟的保護作用效果較明顯(P＜0.05)，其余各組無顯著性差異，結果表明龍須菜多糖對免疫抑制小鼠免疫器官有保護作用，但這種作用與其硫酸基含量無相關性。

2.3 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠細胞免疫功能的影響

2.3.1 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

表2 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on peritoneal macrophage function in immunocompromised mice(± s，n=10)

表2 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on peritoneal macrophage function in immunocompromised mice(± s，n=10)

組別 吞噬率/% 吞噬指數對照組 39.67±9.16 0.497±0.067模型組 33.27±5.15* 0.389±0.063*天然多糖組 45.49±2.14△ 0.508±0.042△硫酸化多糖組 40.14±2.80△ 0.483±0.069△脫硫多糖組 37.12±7.51 0.387±0.136

從表2可以看出，與對照組相比，模型組小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬指數和吞噬百分率顯著降低(P＜0.05)，說明成功建立免疫抑制模型。與模型組相比，天然多糖組和硫酸化多糖組均可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬指數和吞噬率(P＜0.05)，其中天然多糖組作用比硫酸化多糖組強，而脫硫多糖組基本上無提高巨噬細胞吞噬能力。

2.3.2 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

表3 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠免疫細胞活性的影響(±s，n=10)able 3 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune cell activity in immunocompromised mice (± s，n=10)

表3 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠免疫細胞活性的影響(±s，n=10)able 3 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune cell activity in immunocompromised mice (± s，n=10)

組別 脾淋巴細胞增殖指數/% NK細胞殺傷率/%對照組 97.65±1.64 37.8±0.04模型組 58.56±2.34** 12.2±0.15**天然多糖組 69.76±0.78△ 38.1±0.75△△硫酸化多糖組 56.38±4.39 20.8±0.14△脫硫多糖組 59.54±3.68 17.8±0.08△

由表3可見，與對照組相比，模型組小鼠脾淋巴細胞增殖指數顯著降低(P＜0.01)，說明成功建立免疫抑制模型。與模型組比較，天然多糖組對促進脾淋巴細胞增殖作用顯著(P＜0.05)，而硫酸化多糖組和脫硫多糖組則無此作用。

2.3.3 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠NK細胞殺傷活性的的影響

多糖對免疫抑制小鼠脾臟NK細胞殺傷力的影響如表3所示。模型組與對照組的數據表明，CTX能夠顯著抑制NK細胞的殺傷活性(P＜0.01)，說明成功建立免疫抑制模型。與模型組比較，各多糖組均能顯著提高NK細胞殺傷活性，其中天然多糖組差異性極顯著(P＜0.01)。

2.4 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠體液免疫功能的影響

表4 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (±s，n=10)

表4 多糖硫酸化對免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (±s，n=10)

組別 溶血素A540nm 溶血空斑A413nm對照組 0.090±0.025 0.332±0.023模型組 0.061±0.018* 0.248±0.036**天然多糖組 0.107±0.031△△ 0.335±0.058△△硫酸化多糖組 0.091±0.021△△ 0.341±0.053△△脫硫多糖組 0.089±0.024△ 0.289±0.041△△

由表4可見，與對照組比較，模型組溶血素值和溶血空斑形成值顯著下降，說明成功建立免疫抑制模型。與模型組比較， 各多糖組均可顯著或極顯著促進免疫抑制小鼠溶血素和溶血空斑的形成， 吸光度顯著升高(P＜0.01)。結果表明，龍須菜多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能，但多糖脫硫酸基后對體液免疫作用有所下降。

3 討 論

龍須菜多糖能顯著增強由CTX導致的免疫力低下小鼠的免疫能力。在所檢測的各項免疫指標中，以天然多糖對提高脾臟指數、腹腔巨噬細胞吞噬活性，脾細胞增殖指數、NK細胞殺傷活性效果最好。總體上天然多糖顯示出較強的細胞免疫作用，其次是硫酸化多糖，脫硫多糖對細胞免疫作用最弱。在對免疫抑制小鼠體液免疫增強作用方面，天然多糖和硫酸化多糖作用效果接近，脫硫多糖作用效果稍有下降。結果表明，龍須菜多糖脫去硫酸基后免疫作用下降，但多糖硫酸基含量增加其免疫活性未相應增加，說明龍須菜多糖對免疫抑制小鼠免疫增強作用與其硫酸基含量可能存在著某種特定的關系，但非線性關系。

朱地琴等[6]研究發現龍須菜非膠體多糖比膠體多糖有更高免疫活性，并認為這種差異可能主要是由于兩者的硫酸基和甲氧基含量不同造成的。宮春宇等[11]報道了龍須菜多糖具有很好的刺激淋巴細胞增殖作用，但經脫硫酸作用后硫酸基含量下降，刺激作用也顯著下降，這與實驗的研究結果相似。

對硫酸化多糖的抗病毒活性研究發現，除了硫酸基聚陰離子特性外，引入硫酸基后所引起的多糖立體結構的變化也是硫酸化多糖產生生物學活性的重要原因[21]。盡管硫酸基與硫酸多糖的抗病毒活性密切相關，但并不是硫酸基越多活性越強，也不是所有多糖硫酸化后都能產生抗病毒活性，有些多糖硫酸化后反而使其原有活性消失，如裂褶多糖和某些真菌多糖經硫酸化后不但沒有抗病毒活性，而且還失去了其原有的抗腫瘤活性，這被認為可能與多糖本身的立體結構有關[22]。本實驗的研究也顯示出增加天然多糖的硫酸基含量其免疫活性未能增加甚至還會下降，這一結果進一步支持了上述的論點。從本實驗硫酸化修飾后的多糖紅外光譜可以看出多糖經硫酸化修飾后其母體結構雖未見變化，但其組成結構有所改變，這種改變是否導致多糖本身的立體結構發生變化從而影響其免疫作用，值得深入研究探索。

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Immunoregulatory Effects of Sulfurized, Desulfurized and Native Gracilaria lemaneiformis Polysaccharides in Immunosuppressive Mice

CHEN Mei-zhen，YU Jie，YANG La-wei，PAN Qun-wen
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

Q539；TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0278-05

2010-06-12

廣東省科技計劃項目(2009B020312012)；汕頭市科技計劃項目(2008-143)

陳美珍(1956—)，女，副教授，本科，主要從事天然活性物質的研究與開發。E-mail：chenmz@stu.edu.cn