鮮奶中產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌株的篩選與鑒定

李遠(yuǎn)宏，呂鳳霞，鄒曉葵，李 穎,2，陸兆新,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.無(wú)錫市宜興食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 宜興 214206)

鮮奶中產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌株的篩選與鑒定

李遠(yuǎn)宏1，呂鳳霞1，鄒曉葵1，李 穎1,2，陸兆新1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.無(wú)錫市宜興食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 宜興 214206)

從新鮮牛奶中篩選高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌株fmbl12-4，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鑒定菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。當(dāng)fmbl12-4的濕菌體與100mmol/L L-谷氨酸鈉溶液(L-MSG)按1:20(m/V)混合，于30℃、100r/min振蕩反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)化液中GABA濃度達(dá)到82.36mmol/L。在質(zhì)量濃度為2.5g/100mL L-MSG的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到4.68g/L。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；篩選；鑒定

Abstract ：A lactic acid bacterial strain with high γ-aminobutyric acid (γ-GABA)-producing ability, named fmbl12-4, was isolated from fresh milk. Based on the studies of morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence and phylogenic analyses, fmbl12-4 was identified as Lactococcus lactis subsp. lactis. After 24 h shake (100 r/min)incubation of the wet mycelia of fmbl12-4 in a 20-fold volume of 100 mmol/L L-monosodium glutamate solution at 30 ℃, aγ-GABA content of 82.36 mmol/L was obtained. Incubation in a MRS medium containing 25 g/L L-MSG for 6 days gave 4.68 g/L γ-GABA content.

Key words：γ-aminobutyric acid；lactic acid bacteria；isolation and screening；identification

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，廣泛存在于原核生物和真核生物中[1]。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有很多重要的生理功能，如降低血壓、利尿、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶力、預(yù)防糖尿病、治療癲癇、促進(jìn)生殖[2]等。作為一種新型的功能性因子，GABA在食品保健、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

制備GABA的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法。生物合成法是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作為催化劑，將L-谷氨酸(L-Glu)或其鈉鹽α-脫羧生成GABA。相比而言，化學(xué)合成GABA安全性差、環(huán)境污染嚴(yán)重。植物富集的GABA含量較低，微生物發(fā)酵法制備GABA由于不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

乳酸菌是具保健作用的益生菌，是一種公認(rèn)安全的微生物，廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中。目前，Lactobacillus plantarum[3]、Lactobacillus brevis[4]、Lactococcus lactis[5]、Lactobacillus paracasei[6]、Streptococcus salivarius subsp. thermophilus[7]中已發(fā)現(xiàn)具有生物合成GABA的能力。從乳酸菌中篩選高產(chǎn)GABA的菌株是一個(gè)很好的策略。本研究從新鮮牛奶中篩選高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-氨基丁酸(99.0%)、異硫氰酸苯酯 (PITC) Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺(均為色譜純) Tedia公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

乳酸菌分離培養(yǎng)基為含20g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基[8]；菌種活化培養(yǎng)基為體積分?jǐn)?shù)10%的脫脂牛乳培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基為含不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸鈉(L-MSG)的MRS液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 series 高效液相色譜系統(tǒng)(全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫科技公司；5804R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf 公司；LNG-T88臺(tái)式快速冷凍離心濃縮干燥器 太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.3 樣品中乳酸菌菌株分離培養(yǎng)及純化

新鮮牛奶取自安徽科技學(xué)院畜牧科技園。對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，涂布于MRS平板上，于30℃培養(yǎng)48h。挑取肉眼可見、生長(zhǎng)較快、單個(gè)有溶鈣圈的菌落分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢、接觸酶陰性菌株作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌疑似菌株，并將其編號(hào)、保存。

1.4 生產(chǎn)GABA菌株的篩選

1.4.1 菌種的活化培養(yǎng)

將上述分離純化并保存的菌株接種于脫脂牛乳培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至凝乳，然后按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)16h。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化

將活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物在5000r/min、4℃離心15min收集菌體，加入與培養(yǎng)液等量的生理鹽水洗滌菌體3次。濕菌體與100mmol/L的L-谷氨酸鈉溶液按1:20(m/V)充分混合均勻，于30℃、100r/min振蕩反應(yīng)24h。取細(xì)胞轉(zhuǎn)化液進(jìn)行定性分析，并對(duì)高產(chǎn)GABA的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液進(jìn)行定量分析。

1.5 分析方法

1.5.1 定性分析

采用紙層析法。展開劑組成：V(正丁醇):V(冰乙酸):V(水)=4:1:3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為0.4g/100mL的茚三酮。以GABA標(biāo)準(zhǔn)品做參比，待測(cè)樣品點(diǎn)樣5μL。采用新華一號(hào)層析紙展開后于90℃條件下烘干顯色20min。

1.5.2 定量分析

高效液相色譜法測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，洗脫條件略有改動(dòng)，洗脫程序如表1所示。色譜條件：色譜柱采用Agilent:ZORBAX.Eclips XDB-C18柱(15cm×4.6mm，5μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙酸鈉10.254g、三乙胺0.5mL和乙酸0.7mL，調(diào)節(jié)pH5.8，定容至1000mL；流動(dòng)相B為乙腈；流動(dòng)相C為水。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密配制2.000mmol/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其稀釋至0.125、0.250、0.500、0.750、1.000mmol/L。對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品衍生化后定量測(cè)定，以GABA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program for HPLC determination ofγ-GABA

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)觀察及生理生化鑒定

按照參考文獻(xiàn)[8-10]進(jìn)行。

1.6.2 16S rDNA 的擴(kuò)增與測(cè)序

采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物P1：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物P2：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR 反應(yīng)體系(總體積50μL)：10×PCR緩沖液5μL；正、反向引物P1、P2 均為10mmol/L各2.5μL；dNTP (10mmol/L)4μL；基因組DNA 1.0μL；Taq DNA聚合酶0.5μL；雙蒸水34.5μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性45s，55℃退火55s，72℃延伸2min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物測(cè)序由南京金思特生物技術(shù)公司完成。

1.6.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將16S rDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。選擇同源性較高及已報(bào)道產(chǎn)GAD的細(xì)菌16S rDNA核苷酸序列，利用clustalx 2.0進(jìn)行多重聯(lián)配，然后再利用MEGA 4.0軟件采用Neighbour-joining方法以E.coli O157:H7為外群(out-group)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行Bootstrap分析。

1.7 溫度對(duì)GABA積累的影響

將活化的產(chǎn)GABA菌株以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量，接入含質(zhì)量濃度為2.5g/100mL的L-MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于25、30、37、40℃靜置培養(yǎng)。每24h測(cè)定發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度。

1.8 底物質(zhì)量濃度對(duì)GABA積累的影響

將活化的產(chǎn)GABA菌株以2%的接種量，分別接入含質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、5g/100mL的L-MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)。每24h測(cè)定發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及純化

從新鮮牛奶中分離出大量疑似乳酸菌株，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢、接觸酶陰性的菌株產(chǎn)GABA能力進(jìn)行研究。為了能夠從分離的大量疑似乳酸菌菌株中篩選到高產(chǎn)GABA菌株，共對(duì)60株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行了分離、純化，并作為產(chǎn)GABA菌株的篩選對(duì)象。

2.2 產(chǎn)GABA乳酸菌菌株的篩選

2.2.1 定性分析

圖1 菌株轉(zhuǎn)化液紙層析圖譜Fig.1 Paper chromatographic patterns showing the production ofγ-GABA derived from strain fmbl12-4 incubated in L-monosodium glutamate solution

如圖1所示，菌株fmbl12-4的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液存在明顯與GABA標(biāo)準(zhǔn)品Rf一致的茚三酮顯色斑點(diǎn)。初步判定菌株fmbl12-4為產(chǎn)GABA菌株。

2.2.2 定量分析

圖2 GABA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram ofγ-GABA standard

按照參照文獻(xiàn)[9]提供的方法處理GABA標(biāo)準(zhǔn)品，再進(jìn)行HPLC測(cè)定，以峰面積(y)對(duì)GABA濃度(x)作線性回歸，制作GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果在GABA濃度為 0～1mmol/L范圍內(nèi)，GABA獲得了良好的分離，其線性方程為y=23871x+89.099(R2=0.9993)。通過(guò)HPLC定量測(cè)定樣品中的GABA質(zhì)量濃度，由此確定菌株產(chǎn)GABA的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株fmbl12-4的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中均存在一種與GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間相同的物質(zhì)，進(jìn)一步證明了菌株fmbl12-4具有轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-MSG合成GABA的能力。菌株fmbl12-4細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中的L-MSG幾乎全部被轉(zhuǎn)化，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到82.36mmol/L，GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品及細(xì)胞轉(zhuǎn)化液的高效液相色譜圖譜如圖2、3所示。

圖3 菌株fmbl12-4細(xì)胞轉(zhuǎn)化液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the metabolic products after incubation of strain fmbl12-4 in L-monosodium glutamate solution

2.3 菌株fmbl12-4的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征

菌株fmbl12-4在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，其菌落表面光滑、濕潤(rùn)、呈乳白色、邊緣整齊，直徑約1mm，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陽(yáng)性，符合乳酸菌特性。

2.3.2 生理生化特性

參照文獻(xiàn)[8，10]對(duì)菌株fmbl12-4進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。各項(xiàng)檢測(cè)特征均符合文獻(xiàn)[8，10]中關(guān)于乳酸乳球菌的描述，初步判定菌株fmbl12-4為乳酸乳球菌。

表2 菌株fmbl12-4生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain fmb12-4

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.3.1 16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序

以菌株fmbl12-4的總DNA為模板，P1、P2為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到約1.5kb左右的特異性擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)南京金思特生物技術(shù)公司測(cè)序，核苷酸序列大小為1425bp。該序列已經(jīng)在Genbank上進(jìn)行了登記，登記號(hào)為FJ824739.1。

2.3.3.2 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株fmbl12-4的16S rDNA核苷酸序列分別與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株fmbl12-4的16S rDNA核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的5種菌株的16S rDNA核苷酸序列的同源性達(dá)到99%，分別為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、格氏乳桿菌(Lactococcus garvieae)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、耐久腸桿菌(Enterococcus durans)以及11株不可培養(yǎng)微生物。其中明確種屬的有Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus garvieae、Agrobacterium tumefaciens、Enterococcus durans。選擇已報(bào)道產(chǎn)GAD的細(xì)菌16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于具有GAD活性細(xì)菌的16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences based on the 6S rDNA sequences of bacterial strains with GAD activity

由圖4可知，fmbl12-4與Lactococcus lactis subsp.lactis位于同一個(gè)簇群，且同源性達(dá)99%的微生物大部分為L(zhǎng)actococcus lactis subsp. lactis，其他產(chǎn)GAD細(xì)菌的發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

根據(jù)fmbl12-4的形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，將fmbl12-4鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。

2.4 溫度對(duì)GABA積累的影響

GABA在生物體內(nèi)的合成從本質(zhì)上說(shuō)是酶參與的催化反應(yīng)，主要是GAD參與L-Glu或其鹽類α-羧基脫羧而合成的。不同溫度條件下GABA的積累情況如圖5所示。

由圖5可知，菌株fmbl12-4在30℃時(shí)的積累量最大，當(dāng)溫度升高或降低，發(fā)酵液中GABA的積累量都有所降低。這可能是由于菌株fmbl12-4細(xì)胞內(nèi)的GAD活性在30℃時(shí)相對(duì)較高。

圖5 溫度對(duì)GABA積累的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on GABA production

2.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)GABA積累的影響

GABA是在GAD的催化作用下，將L-MSG的α-羧基脫羧而生成的。L-MSG作為生物合成GABA的前體，對(duì)發(fā)酵液中GABA的積累有重要影響。當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度L-MSG時(shí)，發(fā)酵液中GABA的積累情況如圖6所示。

圖6 L-MSG質(zhì)量濃度對(duì)GABA合成的影響Fig.6 Effect of L-MSG concentration on GABA production

由圖6可見，在發(fā)酵過(guò)程中，GABA的積累量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，在前4d GABA質(zhì)量濃度增加較快，發(fā)酵后期GABA質(zhì)量濃度增幅趨緩，基本趨于穩(wěn)定。當(dāng)培養(yǎng)基中L-MSG的質(zhì)量濃度較低時(shí)，發(fā)酵液中GABA的積累隨著L-MSG的增加而顯著增加；在含質(zhì)量濃度為2.5g/100mL的L-MSG的MRS培養(yǎng)基中，菌株fmbl12-4對(duì) GABA的最大積累量達(dá)到4.68g/L；而當(dāng)L-MSG添加量達(dá)到5g/100mL時(shí)，發(fā)酵液中GABA的最大積累量為5.50g/L，GABA的積累量增加趨緩，發(fā)酵液中殘留的L-MSG相對(duì)較多。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中高質(zhì)量濃度的L-MSG抑制了菌體生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致生物量降低。

3 結(jié) 論

由于反應(yīng)液中僅加入底物L(fēng)-MSG，成分簡(jiǎn)單，同時(shí)GAD是生物催化L-Glu及其鹽類的α-羧基脫羧反應(yīng)生成GABA的唯一酶[11]，因而最終細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中僅存在底物L(fēng)-MSG和(或)產(chǎn)物GABA，紙層析后表現(xiàn)為顯色條帶僅為一條或兩條，易于觀察，篩選效率大大提高。發(fā)酵液中的成分復(fù)雜，尤其是含有大量其他種類的氨基酸和蛋白質(zhì)等產(chǎn)物也可以與茚三酮反應(yīng)呈色，GABA顯色斑點(diǎn)易受干擾。相比于利用紙層析分析發(fā)酵液[12-15]中是否存在GABA來(lái)初步篩選GABA產(chǎn)生菌株而言，利用紙層析分析細(xì)胞轉(zhuǎn)化液是一種較為理想的初步篩選GABA生產(chǎn)菌株的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紙層析定性分析細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中是否存在GABA，然后再對(duì)存在明顯GABA顯色斑點(diǎn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC定量測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株是否為GABA產(chǎn)生菌株的方法，從新鮮牛奶樣品中分離篩選了1株高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株fmbl12-4。當(dāng)fmbl12-4的濕菌體與100mmol/L L-MSG 按1:20混合，于30℃、100r/min振蕩反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)化液中GABA濃度達(dá)到82.36mmol/L。在含質(zhì)量濃度為2.5g/100mL的LMSG的MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)6d，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到4.68g/L。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析鑒定菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。

[1] MANYA B V, KATZ L, HARE T A, et al. Isoniazid-induced elevation of cerebrospinal fluid (CSF) GABA levels and effects on chorea in huntington's disease[J]. Annals of Neurology, 1981, 10(1): 35-37.

[2] 楊勝遠(yuǎn), 陸兆新, 呂鳳霞, 等. γ-氨基丁酸的生理功能和研究開發(fā)進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 546-551.

[3] SIRAGUSA S, ANGELIS M D, CAGNO R D, et al. Synthesis ofγaminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses[J]. Applied and Environmental Microbioogy, 2007, 73(22): 7283-7290.

[4] UENO Y, HAYAKAWA K,TAKAHASH S, et al. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from Lactobacillus brevis IFO12005[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, 61:1168-1171.

[5] NOMURA M, NAKJIMA I, FUJITA Y, et al. Lactococcus lactis conteins only one glutamate decarboxylase gene[J]. Microbiology, 1999, 145:1375-1380.

[6] KOMATSUZAKI N, SHIMA J, KAWAMOTO S, et al. Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods[J]. Food Microbiology, 2005, 22: 497-504.

[7] 楊勝遠(yuǎn), 陸兆新, 呂鳳霞, 等. 一株產(chǎn)谷氨酸脫羧酶乳酸菌的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 37(6): 25-30.

[8] 凌代文, 東秀珠. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1999: 4-5; 35; 46-47; 85.

[9] 楊勝遠(yuǎn), 陸兆新, 焦陽(yáng), 等. 高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵醪中的γ-氨基丁酸[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 2007, 26(4): 331-334.

[10] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001:260-264; 370-373.

[11] 楊勝遠(yuǎn), 陸兆新, 呂鳳霞, 等. 微生物谷氨酸脫羧酶研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 354-360.

[12] 夏江, 梅樂(lè)和, 黃俊, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌株篩選及誘變[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 20(5): 379-382.

[13] 冀林立, 方芳, 魏小雁, 等. 傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)γ- 氨基丁酸乳酸菌的篩選[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2008, 36(5): 4-7; 15.

[14] 徐冬云, 周立平, 童振宇, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離篩選[J].現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(3): 59-64.

[15] 李海星, 江英英, 曹郁生. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及初步鑒定[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2007, 19(3): 455-457; 510.

Isolation and Screening of a Gamma-Aminobutyric Acid-producing Lactic Acid Bacterial (LCB) Strain from Fresh Milk

LI Yuan-hong1，LFeng-xia1，ZOU Xiao-kui1，LI Ying1,2，LU Zhao-xin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Yixing Food and Drug Administration, Yixing 214206, China)

Q939

A

1002-6630(2010)15-0198-05

2009-10-27

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z357)

李遠(yuǎn)宏(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：ahyhongl@sina.com

*通信作者：陸兆新(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锖褪称飞锛夹g(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn