玉竹中性多糖的分離純化及單糖組成分析

王 強(qiáng)，李盛鈺，楊 帆，劉春明,*

(1.長春師范學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130032；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033)

玉竹中性多糖的分離純化及單糖組成分析

王 強(qiáng)1，李盛鈺2，楊 帆1，劉春明1,*

(1.長春師范學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130032；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033)

采用水提醇沉方法提取玉竹(Polygonatum odoratum (Mill) Druce)粗多糖，通過DEAE-纖維素離子交換層析和Sepharose CL-6B分子篩層析分離純化得到玉竹中性多糖。應(yīng)用紫外光譜分析中性多糖的純度，凝膠過濾法測定其分子質(zhì)量，紅外光譜和高效液相色譜對其結(jié)構(gòu)和單糖組成進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明：玉竹多糖主要為中性多糖，同時含有少量酸性多糖；玉竹中性多糖平均分子質(zhì)量為1.21×106D，主要由甘露糖和葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比為5:1，同時含有少量半乳糖。

玉竹；多糖；純化；單糖組成

Abstract ：Crude polysaccharides were obtained from Polygonatum odoratum (Mill) Druce by water extraction and ethanol precipitation, and were sequentially purified by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose column and gel permeation chromatography on Sepharose CL-6B column and a neutral polysaccharide fraction was obtained. Its structure was determined using HPLC, FTIR and UV spectroscopy. The results showed that the polysaccharide fraction was mainly composed of mannose and glucose at a molar ratio of 5:1 and also contained a small amount of galactose and that its molecular weight was approximately 1.21 × 106D.

Key words：Polygonatum odoratum (Mill) Druce；polysaccharide；purification；monosaccharide composition

玉竹為百合科(Liliaceae)植物玉竹(Polygonatum odoratum (Mill) Druce)的干燥根莖，是藥食兩用中藥之一，具有養(yǎng)陰潤燥，生津止渴的功效[1]。從玉竹中已經(jīng)分離鑒定了甾體皂苷、黃酮、生物堿、多糖、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強(qiáng)心苷等多類成分[2]，其中多糖是玉竹中主要有效成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明其具有增強(qiáng)耐缺氧[3]、抗衰老[4-5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、抗腫瘤和提高免疫力[8]等作用，因此，開發(fā)玉竹多糖具有重要意義。對玉竹多糖的提取工藝已有研究[9]，但對玉竹多糖的分離純化及單糖組成方面的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從玉竹中分離純化了一種中性多糖，并利用紅外光譜、紫外光譜、液相色譜和凝膠過濾色譜等方法，對其理化性質(zhì)及單糖組成進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉竹采于吉林省集安市，經(jīng)鑒定為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)植物玉竹(Polygonatum odoratum (Mill)Druce)的干燥根莖。

DEAE-纖維素 上海恒信公司；Sepharose CL-4B填料 瑞典Phamacia公司 ；標(biāo)準(zhǔn)單糖 加拿大Bio Basic公司；Dextran標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 美國Fluka公司；6000～8000D透析袋 上海綠谷有限公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；NICOLET380紅外分光光度計(jì) 美國Thermo公司；DU800紫外可見分光光度計(jì) 美國Beckman Coulter公司；ALPHA2-4 LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；3K30臺式冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3 玉竹粗多糖的提取

稱取過20目篩的玉竹粗粉100g，加入600mL水，置于80℃水浴中提取3次，每次1h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，4℃放置過夜，4℃、8000r/min離心15min，沉淀加蒸餾水50mL溶解，4℃、8000r/min離心15min，上清液凍干。

1.4 玉竹中性多糖的分離純化

稱取玉竹粗多糖樣品0.1g，加入10mL水使其溶解，上樣到平衡后的DEAE-纖維素柱上。依次用蒸餾水、0.2mol/L NaCl和0.5mol/L NaCl溶液洗脫樣品。流速1mL/min，部分收集器收集洗脫液，每管5mL，苯酚-硫酸法檢測多糖含量，按照吸收峰收集各樣品，去離子水透析，凍干。取水洗脫部分經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱進(jìn)一步純化。以0.9g/100mL NaCl溶液洗脫，流速為0.4mL/min，部分收集器收集洗脫液，每20min收集一管，苯酚-硫酸法檢測多糖含量，按照吸收峰收集樣品，去離子水透析，凍干，即得玉竹中性多糖。

1.5 玉竹中性多糖組成分析[10]

玉竹中性多糖的水解：稱取玉竹中性多糖1mg，加入2mol/L的三氟乙酸溶液1mL，密封，于110℃水解4h，水解后樣品凍干。

單糖衍生物制備：稱取各標(biāo)準(zhǔn)單糖1mg與玉竹中性多糖水解后樣品分別加入0.3mol/L的NaOH溶液1mL，配成1 mg/mL的NaOH溶液。分別量取100μL加入1.5mL離心管中，加入0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液100μL，密閉。于70℃水浴30min，取出，冷卻10min，加入0.3mol/L的HCl溶液100μL，混勻，再加入1mL氯仿，混勻，10000r/min離心5min，吸去氯仿層(下層)，上層(水層)經(jīng)過0.45μm濾膜過濾，加超純水至1mL，供HPLC分析用。

HPLC分析條件：Agilent 1100系統(tǒng)。DAD檢測器，檢測波長：250nm，柱溫：35℃，流速：1.0mL/min，Ecilipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相：82.2% PBS緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)和17.8%乙腈(V/V)。進(jìn)樣量10μL。將各單糖衍生物混合樣品注入HPLC中，進(jìn)行分析。

1.6 玉竹中性多糖分子質(zhì)量測定

采用Sepharose CL-4B凝膠柱(1.0cm×100cm)過濾層析，0.9g/100mLNaCl洗脫，流速0.1mL/min。部分收集器收集洗脫液，每管2mL，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量。以不同Dextran標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(MW2000、750、500、70、40kD和25kD)最大吸光度時的洗脫體積為橫坐標(biāo)，各Dextran標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉竹中性多糖樣品以同樣條件上柱，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子質(zhì)量。

1.7 玉竹中性多糖紫外光譜和紅外光譜測定

紫外光譜分析以1mg/mL的玉竹中性多糖溶液在200～800nm范圍內(nèi)掃描。紅外光譜測定取2mg的中性多糖樣品，以KBr壓片，在4000～400cm-1區(qū)間掃描紅外吸收。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉竹中性多糖的分離純化

玉竹經(jīng)水提醇沉得到粗多糖為白色纖維狀固體，不易溶于冷水，在熱水中具有較好的溶解性，不溶于丙酮，乙醇等有機(jī)溶劑，粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱色譜，依次以蒸餾水、0.2mol/LNaCl和0.5mol/L NaCl洗脫，分離得到3個組分，其中蒸餾水洗脫部分的量最多，約占上樣粗多糖量的80%(圖 1)。說明玉竹多糖主要為中性多糖，同時含有少量酸性多糖。DEAE-纖維素(二乙氨乙基纖維素，Dicthylaminoethyl)在纖維素上結(jié)合了DEAE，帶正電荷的陽離子纖維素-O-C6H14N+H，可與帶負(fù)電荷的陰離子進(jìn)行交換，在離子交換色譜中，交換劑對多糖和無機(jī)陰離子都具有交換吸附的能力，兩者同時存在于一個色譜過程中，一般采用兩種方法達(dá)到分離多糖的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。實(shí)驗(yàn)采用不同離子強(qiáng)度NaCl進(jìn)行洗脫，分離效果好。取中性多糖部分經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠過濾層析純化，得到玉竹中性多糖。由圖2洗脫曲線可知，洗脫峰為單一對稱峰，表明其組分為單一組分。

圖1 玉竹粗多糖DEAE-纖維素離子交換柱層析Fig.1 DEAE-cellulose column chromatogram of crude polysaccharides from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

圖2 玉竹中性多糖Sepharose CL-6B分子篩層析Fig.2 Sepharose CL-6B column chromatogram of the neutral fraction of crude polysaccharides from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

2.2 玉竹中性多糖分子質(zhì)量測定

標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量葡聚糖凝膠過濾法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y =－22.594x+209.1(R2=0.9966)。玉竹中性多糖根據(jù)洗脫體積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)比較，求得其分子質(zhì)量為1.21×106D。

2.3 玉竹中性多糖組成分析

玉竹中性多糖組成分析是多糖結(jié)構(gòu)分析的一項(xiàng)重要內(nèi)容。近年來發(fā)展迅速的柱前衍生化方法是使糖類物質(zhì)帶上紫外或熒光基團(tuán)，用HPLC進(jìn)行分離，在紫外或熒光下檢測，這種方法具有分離效率高、分析時間短、進(jìn)樣量少、檢測限低及多模式等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)先將玉竹中性多糖經(jīng)三氟乙酸水解、PMP衍生化后通過高效液相測定其單糖組成。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of dextran

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖與玉竹中性多糖的PMP衍生物高效液相色譜圖Fig.4 HPLC analysis of PMP derivatized standard monosaccharides and the purified neutral polysaccharide fraction from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

由圖4可知，玉竹中性多糖PMP衍生物存在3個色譜峰，由標(biāo)準(zhǔn)單糖對照(圖4B)可知樣品中主要含有甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)，物質(zhì)的量比為5:1，同時含有少量半乳糖(Gal)。

2.4 玉竹中性多糖紫外和紅外光譜分析

圖5玉竹中性多糖紫外光譜圖中，在波長260nm和280nm處無蛋白、核酸吸收峰，表明多糖中無蛋白、多肽及核酸的存在。圖6是玉竹中性多糖的紅外光譜圖，顯示了明顯的多糖特征吸收峰。在3441.50、2924.37、1633.86、1383.80、1250.16cm-1和1030.55cm-1等處均有多糖的特征吸收，3441.50cm-1處強(qiáng)且寬的吸收峰，主要由O—H伸縮振動引起的；2924.37cm-1是—CH2的C—H鍵的伸縮振動引起的，1633.86cm-1是C==O的伸縮振動引起的，1383.80cm-1是C—O伸縮振動引起的；1250.16、1030.55cm-1是吡喃糖環(huán)的特征吸收引起的，是其C—O—C的非對稱振動峰。

圖5 玉竹中性多糖紫外光譜圖Fig.5 UV absorption spectrum of the purified neutral polysaccharide fraction from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

圖6 玉竹中性多糖紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum of the purified neutral polysaccharide fraction from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

3 結(jié) 論

本研究采用水提醇沉法從玉竹中提取總多糖，通過DEAE-纖維素離子交換層析和Sepharose CL-6B分子篩層析分離純化得到一種中性多糖，應(yīng)用UV光譜分析了中性多糖的純度，凝膠過濾法測定了其分子質(zhì)量，IR光譜和HPLC色譜對其結(jié)構(gòu)和單糖組成進(jìn)行初步分析，表明其平均分子質(zhì)量為1.21×106D，主要由甘露糖和葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比為5:1，同時含有少量半乳糖。

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Isolation, Purification and Monosaccharide Analysis of a Neutral Polysaccharide from Polygonatum odoratum (Mill) Druce

WANG Qiang1， LI Sheng-yu2，YANG Fan1，LIU Chun-ming1,*
(1. Central Laboratory of Changchun Normal University, Changchun 130032, China；2. Center of Agro-food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)15-0100-03

2009-12-10

王強(qiáng)(1976－)，男，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail：cczywq@163.com

*通信作者：劉春明(1964－)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物分析。E-mail：chunmingliu2000@yahoo.com.cn