皮膚組織中SOD活性測定的樣品制備方法

潘衛松 ，肖 瑛 ，李 薇

（1.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510610；2.暨南大學藥學院，廣東廣州 510632；3.暨南大學中藥藥效物質基礎及創新藥物研究廣東省高校重點實驗室,廣東廣州 510632）

超氧化物歧化酶（SOD）是生物機體內重要的自由基清除酶，其活性的高低表征著機體的抗氧化能力和衰老程度。目前實驗室里比較普遍的SOD測定方法是黃嘌呤氧化酶法[1]。病理改變的過程中，機體功能改變一般是先于結構變化的，因此評價化妝品和藥物是否確實能夠延緩皮膚組織的衰老，皮膚組織中的SOD活性是一個有意義的評價指標。由于皮膚組織中SOD活性測定方法的報道較少，目前市面上SOD試劑盒也無法直接測出大鼠皮膚組織中SOD酶的活性，因此本研究以南京建成生物工程公司的SOD試劑盒為基礎，建立了測定皮膚組織中SOD活性的方法，為評價化妝品、保健品和中藥的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠 6只，由廣州中醫藥大學實驗動物中心蘇小茹老師提供；動物合格證號：粵監證字2005A008。

1.2 儀器和試劑

電動玻璃勻漿器（江蘇金壇市佳美儀器廠）；SCJ10005低溫高速離心機；紫外分光光度計 （CARY 100）；恒溫水?。℅RANT SUB14）；MSI旋渦混合器 （廣州 IKA 公司）；SOD 試劑盒（南京建成生物工程公司，批號：20070126）；牛血清白蛋白（Biotech 級，AMRESCO 公司，批號：303903A）；其他試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

大鼠取皮膚組織約0.5 g，加預冷的生理鹽水，置電動玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿8 min，制成10%的皮膚勻漿液。將勻漿液平分成兩份，分別以3 000 r/min，0℃離心10 min和15 min，所得上清液即為粗酶液。然后分別取粗酶液加入底物溶液，以旋渦混合器振蕩0.5min，使之混合均勻后置37℃恒溫水浴40min后，取出加入顯色劑，在旋渦混合器上混勻，室溫放置10 min后，在550 nm處測定吸光度。同法平行制備空白管，作為空白對照。以對照管吸光度減去反應管吸光度的差值比上對照管吸光度值的結果計算SOD的活性。粗酶液以考馬斯亮藍法[2]測定其中蛋白含量，以牛血清白蛋白溶液做標準曲線。

2.2 結果

不同測定條件下SOD酶的百分抑制率見表1。6個不同條件下的SOD酶的百分抑制率均為15%～55%。蛋白定量的標準曲線：Y＝1.783 4X－0.136 6（r＝0.991 5），線性范圍為 0.2～1.6 mg/ml。各個條件下的粗酶液的蛋白含量見表2。由表1、2可知，在轉速為3 000 r/min時，離心時間的長短對粗酶液中蛋白含量沒有明顯的影響。

表1 不同測定條件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

表1 不同測定條件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

離心時間（min） 取樣量（μl）60 80 100 10 15 40.66±5.89 34.32±7.37 42.00±7.03 37.85±3.63 46.55±3.53 43.00±4.74

表2 不同測定條件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

表2 不同測定條件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

離心時間 10 min 15 min 1.002 8±0.325 7 1.042 9±0.367 0蛋白含量

3 討論

藥品評價正日益受到重視，針對藥品，保健品和化妝品的安全性和有效性、功能性評價得到了廣泛開展[3-6]。目前國內藥品、保健品和化妝品對抗皮膚衰老功效評價的實驗研究尚少見報道。筆者在進行有關中藥抗皮膚衰老的評價時，選擇測定皮膚組織中SOD酶的活性來評價此類中藥的功效。經過比較市面上現有的SOD試劑盒后，筆者選擇了南京建成生物工程公司生產的SOD試劑盒來測定大鼠皮膚組織中的SOD活性。預實驗發現，如果完全按照試劑盒說明書的要求，取30～50 μl所制備的1%皮膚組織勻漿液將無法測出SOD活性。因此本研究通過改進樣品處理方法以建立測定皮膚組織中SOD活性的方法。

經過預實驗，筆者選擇制備10%的皮膚組織勻漿，經過0℃，3 000 r/min，10 min或15 min的離心制備SOD的粗酶液，然后分別取60、80和100 μl的樣品測定皮膚組織中SOD酶的活性，從中選取最佳的測定條件。結果表明所測定的SOD酶百分抑制率均在15%～55%范圍內。由于酶活測定的最佳取樣量為百分抑制率在48%～50%，故在上述結果中，SOD酶活測定的最佳條件是在0℃，3 000 r/min條件下離心10 min之后，取上清液100 μl進行測定。

在測定全血和肝、腦組織中SOD酶活的過程中，筆者使用雙縮脲法測定樣品中的蛋白含量，但皮膚組織的勻漿液在離心后，其蛋白含量低于雙縮脲法的線性范圍，于是筆者采用考馬斯亮藍法來測定皮膚組織中SOD酶的粗酶液的蛋白含量。 結果表明，該法回歸曲線的線性范圍為 0.2～1.6 mg/ml，標準曲線的相關系數r=0.991 5，能夠滿足測定SOD酶粗酶液中蛋白含量的要求。

通過本實驗，筆者建立了利用南京建成生物工程公司SOD試劑盒來測定皮膚組織中SOD活性的方法，為評價中藥和化妝品對皮膚組織的抗氧化和抗衰老功能奠定了基礎。

[1]李忠琴,許小平,楊海麟,等.辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶的活性[J].分析化學,2006,34(6)∶821-824.

[2]John A,Smith.精編分子生物學實驗指南[M].北京∶科學出版社,332-333.

[3]肖斌,張新蘭.從藥品評價平臺建設看我國科技評價的發展趨勢[J].中國醫藥導報,2010,7(5)∶5-6.

[4]潘衛松,肖瑛.透明質酸鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國醫藥導報,2009,6(20)∶45-47.

[5]房林,趙振民.皮膚衰老機制的研究進展[J].北京∶人民軍醫,2010,53(2)∶149-152.

[6]潘衛松,肖瑛,潘建明.熒光素鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國藥房,2009,20(13)∶1010-1012.