體外培養間充質干細胞移植對頸動脈損傷后局部NO含量和eNOS mRNA表達的影響1)

趙然尊,石 蓓,郭 艷,許官學,王冬梅,沈長銀

再狹窄是臨床冠心病介入治療后較嚴重的遠期并發癥。基礎研究發現,再狹窄的病理機制包括早期內皮細胞損傷、血管彈性回縮和平滑肌細胞的遷移與增殖、新生內膜增生及晚期血管重塑。現階段藥物洗脫支架治療可明顯抑制平滑肌細胞增殖和新生內膜的增生,降低了再狹窄發生率;然而,支架植入術可引起不同程度的血管壁損傷,并因此加重局部炎癥反應而導致更嚴重的內皮功能障礙和新生內膜增生等病理損傷修復反應。近年研究表明,間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有促進損傷動脈內皮修復和抑制新生內膜增生的作用[1]。但正常個體外周血循環中MSCs含量極少,動脈損傷后其上述作用效應較弱,不足以阻斷再狹窄的發生。本研究在建立兔頸動脈粥樣硬化狹窄基礎上行球囊損傷,經靜脈移植自體間充質干細胞,觀察其對粥樣硬化頸動脈球囊損傷后再內皮化和內膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 頸動脈粥樣硬化模型制備 選用健康純種大白兔為研究對象,體重2.0 kg±0.5 kg,雌雄不限(均購自第三軍醫大學動物中心)。大白兔采用經高脂飲食喂養2個月后,制作頸動脈粥樣硬化模型,具體制作步驟:以25%烏拉坦1 g/kg耳緣靜脈麻醉。無菌條件下,于兔頸前正中皮膚切開3 cm～4 cm的縱切口,充分分離顯露右頸外動脈,將右頸外動脈固定于自制的有機玻璃血管槽中,動脈兩端以橡皮筋拉緊阻斷血流。10 mL注射器內裝生理鹽水,接4.5號頭皮針,平行于血管縱軸方向穿刺阻斷血管的一端進入血管內,充盈血管。另一端用4.5號頭皮針穿刺進入血管,生理鹽水沖洗置換處血管腔內的血液后,空氣置換出血管內生理鹽水。接上流量150mL/min的醫用氮氣氣流,歷時15 min造成內皮干燥,內膜損傷。然后生理鹽水置換出血管腔內的氣體,放開動脈兩端橡皮筋恢復血流,壓迫穿刺點4 min～5 min止血,縫合皮下組織和皮膚并包扎。總計完成48只動物模型,隨機分為兩組,MSCs移植組(n=30)即于球囊損傷后即刻、1周和2周時給予MSCs經耳緣靜脈移植;對照組(n=18)于球囊損傷后相同時間點給予等量生理鹽水注射。

1.2 MSCs來源與體外培養 MSCs移植組所有動物于球囊損傷前1個月皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,商品名:賽強,長春金賽藥業有限責任公司生產)25 μ g/kg,連續 5 d后,然后采集外周血2次～3次,采用密度梯度離心法并貼壁培養法,分離培養獲得MSCs,經流式細胞儀鑒定細胞表面抗原,一般認為,MSCs均一表達CD44陽性,而 CD34、CD45陰性(USBiological公司,USA),且要求純度達95%以上。

1.3 MSCs靜脈移植 培養的MSCs制成細胞懸液,經鑒定細胞濃度達到108/50 μ L。MSCs移植組于球囊擴張后即刻、1周和2周時經耳緣靜脈緩慢注射MSCs懸液每次約2 mL。

1.4 損傷動脈病理形態學測定 兩組動物均于術后4周處死,取出球囊損傷的頸動脈約2.0 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,24 h后常規乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,然后每份標本橫斷面非連續取4處切片,切片厚度 5 μ m,經蘇木精-伊紅(HE)法染色由計算機圖像分析儀分析測定下述指標:新近內膜面積(NEA)、中膜面積(M A)、計算內膜/中膜面積比(I/M)。指標界定如下:新近內膜面積即血管腔表面與內彈力膜之間的面積;中膜面積即內彈力膜與外彈力膜之間的面積;內膜/中膜面積比即新近內膜面積/中膜面積。

1.5 損傷動脈細胞增殖程度檢測 免疫組織化學染色測定增殖細胞核抗原(PCNA):采用鏈霉親和素-生物素過氧化物酶復合物(SABC)法,嚴格按照試劑盒(購自上海源葉生物科技有限公司)操作步驟進,染色陽性細胞表現為細胞核呈棕褐色,400倍光學顯微鏡下計數10個視野內的細胞總數,表達指數用百分比表示。

1.6 損傷動脈局部NO含量測定及eNOS mRNA檢測 NO含量采用ELISA法測定,嚴格按照試劑盒(購自上海晶天生物科技有限公司)操作規程進行。利用 RT-PCR檢測eNOS mRNA表達。根據文獻報道,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。eNOS(599bp)引物序列為:上游:5'-GCCGGATCCTCCAGG AGGGTGTCCACCTG-3',下游:5'-CCGGAATTCGAATACCAGCCTGATCCATGGAA-3'。 以 β-action(540bp)作為內參物,上游:5'-GTGGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3',下游:5'-CTCTT TGATGTCA CGCACGATT TC-3'。PCR條件為:94℃1 min,68℃1 min,72℃3 min,首次循環94℃3 min,共35個循環,結束前72℃25 min,以充分延伸。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙啶染色45 min,反射紫外燈下攝片,光密度掃描,以β-action光密度值作為內參照物,eNOS表達量用二者光密度比值表示。

1.7 統計學處理 采用SPSS 12.0統計軟件,組間比較用方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 FACS鑒定外周血分離培養的M SCs(見圖 1) 可見MSCs均一表達CD44陽性而CD34、CD45陰性,且純度達95%以上。

圖1 FACS檢測MSCs細胞表面抗原標記

2.2 頸動脈病理形態學檢查 正常情況下,頸動脈內皮光滑,內皮細胞飽滿,呈長梭形,長軸與血流方向一致。球囊損傷后4周病理切片掃描電鏡觀察顯示,對照組見頸動脈內皮細胞缺失,部分內皮片狀剝脫,局部有微血栓形成,動脈管壁全周明顯增厚,管腔狹窄較明顯,內膜管腔面可見纖維組織增生形成纖維帽,纖維帽下中膜內可見較多的泡沫細胞沉積,并伴有淡紅染無定形物質形成,呈動脈粥樣硬化中晚期(纖維斑塊-粥樣斑塊期)改變;MSCs移植組頸動脈內皮細胞少量缺失,但無內皮的片狀剝脫,管壁部分區域輕度增厚,管腔輕度狹窄,增厚處中膜可見少量泡沫細胞沉積,部分區域伴少量纖維組織增生,呈動脈粥樣硬化早中期(脂紋-纖維斑塊期)改變。

2.3 新生內膜及中膜面積測定 與對照組相比較,MSCs移植組新生內膜面積(NEA)和中膜面積(MA)均明顯減少(P＜0.05),而兩組間新生內膜/中膜面積比差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 MSCs移植組和對照組新生內膜與中膜面積比較(±s)

表1 MSCs移植組和對照組新生內膜與中膜面積比較(±s)

組別 n NEA(mm2) M A(mm2) I/M MSCs移植組 30 0.336±0.018 0.245±0.017 1.371±0.158對照組 18 0.845±0.0461)0.551±0.0241)1.534±0.014與對照組相比較,1)P＜0.05

2.4 細胞增殖程度測定 MSCs移植組細胞核增殖抗原PCNA陽性細胞率顯著低于對照組[(0.236±0.014)%vs(0.881±0.017)%,P＜0.05]。

2.5 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(見表2) MSCs移植組NO含量和eNOS mRNA表達均明顯高于對照組,差異具有統計學意義。同時,eNOS mRNA表達程度與4周時動脈內膜增生情況相關分析顯示呈負相關(r=0.943,P＜0.05)。詳見表 2。

表2 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(±s)

表2 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(±s)

組別 n NO含量μ mol/gprot eNOS mRNA%M SCs移植組 30 0.984±0.027 0.871±0.024對照組 18 0.305±0.019 0.291±0.032 P＜0.05 ＜0.05

3 討 論

冠心病是嚴重威脅中老年健康的常見疾病,PCI手術作為冠狀動脈血運重建的有效手段,有效地解決血管狹窄,緩解心肌缺血導致的心絞痛等癥狀。然而,球囊擴張及支架植入均可不同程度地造成了血管內膜損傷和撕裂,加重局部炎癥反應,導致嚴重的內皮功能障礙,進而引起一系列級聯反應包括平滑肌細胞增殖、遷移及新近內膜增生等病理損傷修復反應,最終導致再狹窄的發生。基礎研究表明,MSCs經體外誘導能夠向心肌細胞、內皮細胞等方向分化[1-4]。Silva等[5]將標記的MSCs經心肌注射給慢性心肌缺血的犬模型,發現缺血心肌毛細血管密度增加,免疫染色顯示增加的毛細血管被覆標記的內皮細胞,證明MSCs有能力分化為內皮細胞,促進血管再內皮化[6,7]。但MSCs在正常人外周循環中含量極少,這種有益的作用不足對抗由于球囊擴張或支架植入引起的內皮損傷和內膜反應性增生。

血管內膜損傷后愈合過程包括內膜撕裂激活血小板和白細胞黏附聚集,釋放出大量趨化因子和促有絲分裂因子,進而導致中膜平滑肌細胞增生、遷移至內膜形成新生內膜,最終細胞外基質合成增加,基質沉積增加,導致新生內膜面積擴大。本研究采用經高脂飲食喂養結合氮氣損傷制作頸動脈粥樣硬化大白兔模型,在此基礎上給予球囊損傷。細胞移植4周后病理形態學檢查顯示,MSCs移植組頸動脈內皮細胞少量缺失,但無內皮的片狀剝脫,管壁部分區域輕度增厚,管腔輕度狹窄,增厚處中膜可見少量泡沫細胞沉積,部分區域伴少量纖維組織增生,呈動脈粥樣硬化早中期(脂紋-纖維斑塊期)改變;而對照組見頸動脈內皮細胞缺失,部分內皮片狀剝脫,局部有微血栓形成,動脈管壁全周明顯增厚,管腔狹窄較明顯,內膜管腔面可見纖維組織增生形成纖維帽,纖維帽下中膜內可見較多的泡沫細胞沉積,并伴有淡紅染無定形物質形成,呈動脈粥樣硬化中晚期(纖維斑塊-粥樣斑塊期)改變。上述研究結果提示,在損傷血管的病理修復的過程中MSCs移植可能發揮了有益作用。

本研究通過計算機軟件分析系統測量了頸動脈新生內膜和中膜面積,結果顯示,與對照組相比較,MSCs移植組新生內膜面積和中膜面積均明顯減少(P＜0.05);雖然兩組間新生內膜面積/中膜面積差異無統計學意義,但與MSCs移植組相比,對照組新生內膜增生程度更為明顯。同時血管壁PCNA測定顯示MSCs移植組細胞核增殖抗原陽性細胞率顯著低于對照組,提示MSCs移植治療可能顯著抑制了新生內膜增生,其在降低損傷動脈壁的細胞增殖和內皮修復中可能發揮重要作用,其機制可能與靜脈移植的MSCs歸巢至球囊損傷的頸動脈,促進內皮再生,降低局部炎癥反應等有關;而內皮結構和功能的恢復能夠有效地抑制血管平滑肌細胞增殖和新生內膜增生,從而降低再狹窄的發生[8-10]。此外,移植MSCs的旁分泌機制如分泌血管內皮細胞生長因子在抑制局部炎癥反應、促進血管生成等方面的有益作用亦可能參與了內皮的修復[11]。

一氧化氮是一種小分子的活性物質,在心血管系統中,NO在維持血管張力的恒定和調節血壓的穩定性中起著重要作用,是血管內皮細胞發揮作用的重要分子。同時,NO還可抑制平滑肌細胞激活分裂,作用于許多環節促進凋亡,抑制平滑肌細胞的遷移與增殖。本研究發現,MSCs移植組mRNA表達均明顯高于對照組,差異具有統計學意義。同時,eNOS mRNA表達程度與4周時動脈內膜增生情況相關分析顯示呈負相關。這提示,MSCs移植治療后新生內膜增生程度降低可能部分與移植的MSCs重建內皮功能,從而抑制平滑肌細胞遷移和增殖有關。

總之,本研究通過構建接近于臨床上冠心病病變后的支架植入治療模式的大白兔模型,采用MSCs靜脈移植治療,發現其可明顯降低球囊損傷后的粥樣硬化頸動脈的新生內膜增生,并在一定程度上促進內皮再生和修復,其機制部分與移植的MSCs重建內皮功能有關。此研究結果對臨床上血管成形術后防治再狹窄的防治提供了重要的動物實驗數據。

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