超微六味地黃湯對孕期被動吸煙胎鼠腦抗氧化能力的影響1)

屈 波,蔡光先,劉柏炎,潘小平,何澤云

腦發育過程中存在著大量神經元的增殖以及凋亡。許多因子參與此過程。臨床調查研究表明,被動吸煙者胎兒會出現發育遲緩,表現為體格發育緩慢,而且可能伴隨智力發育低下,如弱智、多動癥等。Kelsey等[1]調查研究顯示,孕婦吸煙者所生嬰兒中樞神經系統畸形的發生率增高。給大鼠注射尼古丁溶解液成功地制備出致畸模型,并證實尼古丁是一種神經致畸劑。我國吸煙人數為3.5億,居世界各國之首,女性吸煙率并不高,但由于男性吸煙率居高不下,超過一半的婦女每日生活在二手煙霧環境中,成為被動吸煙的主要受害人群。因此有必要深入探討香煙對發育中腦的影響以及相關的防治藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級ICR小鼠50只,雄性25只,體重22 g～25 g;雌性25只,體重20 g～22 g,由上海西普爾-比凱實驗動物有限公司提供。實驗動物合格證:2003—002。

1.1.2 藥物 六味地黃湯處方來源于《小兒藥證直訣》,組成:熟地黃240 g,山萸肉120 g,山藥120 g,澤瀉90 g,牡丹皮90 g,茯苓90 g。藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科,經鑒定符合2005年《藥典》標準。超微粉制備由湖南省中醫藥研究院湖南省超微工程技術中心參考有關標準制備[2]。

分別稱取傳統六味地黃湯120 g和超微六味地黃湯120 g(其比例如處方)。傳統飲片按《藥典》要求煎煮,取兩次煎液混合,水浴蒸發濃縮為含生藥2.0 g/mL。超微飲片按照標準浸泡法[3],即第1次加90℃10倍于藥材的水,第2次加90℃5倍于藥材的水,各浸泡20 min后,取濾液,用定量濾紙過濾,合并濾液,水浴蒸發濃縮成含生藥1.5 g/mL。

1.1.3 試劑 芙蓉牌香煙(烤煙型,焦油含量 15 mg,一氧化碳13 mg,煙堿1.0 mg),常德卷煙廠;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.1.4 儀器 WFZ75紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司),北京醫療器械廠GSY型恒溫水浴鍋;哈爾濱GK2-80振動超微粉碎機;貝克曼低溫高速離心機;湖南中醫藥大學實驗動物中心被動吸煙裝置。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 孕鼠隨機分為5組,每組10只。正常對照組(A組);模型組(B組):孕第 7天開始熏煙;超微六味地黃湯全量組(C組)、超微六味地黃湯 1/3量組(D組)、傳統六味地黃湯組(E組):孕第7天開始熏煙灌胃。所有動物于孕19 d處死。正常對照組動物不被動吸煙,不做任何處理,與其他組飼養條件相同。根據課題組前期的工作,C組灌服超微六味地黃湯浸膏27.3 g/kg,每日1次;D組灌服超微六味地黃湯浸膏9.1 g/kg,每日1次;E組灌服六味地黃湯浸膏 27.3 g/kg,每日1次。所有動物灌液量均為0.5 mL。模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 動物模型復制 動物于18:00時按雌雄2:1合籠,次日8:30取出雌鼠,發現陰道栓者確定孕期為0.5 d,記為E0.5。造模按文獻的方法采用被動吸煙法[4],于E7～E10,將小鼠置于特制的密閉容器中(10 L),每天熏煙4次,每次15 min,每只小鼠每次燃燒香煙1.5支,兩次間隔為 3 h;至E11～E18,每只小鼠燃燒香煙2支,間隔時間和持續時間同前。

1.2.3 取材和標本處理 各組孕鼠E19取材。10%水合氯醛腹腔麻醉,剪開腹腔,暴露子宮,從游離端分離子宮,取出胚胎,0.01 mol/L PBS沖洗血污。胎鼠取全腦,按照重量體積比用生理鹽水制備成10%腦組織勻漿液,4℃3 000 r/min離心10 min后取上清液備用。

1.2.4 SOD和MDA檢測 嚴格按照試劑盒方法操作。在550 nm波長條件下用分光光度計測定其OD值(光密度),并計算SOD的活性:SOD[U/(mg?prot)]=(OD對照管-OD測定管)/OD對照管÷50%×反應液總量/取樣量÷蛋白含量。在532 nm波長處測定其OD值(光密度),再按下式求出MDA生成量:M DA[nmol/(mg?prot)]=(OD測定管-OD空白管)/(OD標準管-OD標準空白管)×標準品濃度÷蛋白含量。

2 結 果

SOD:與A組相比,B組胎鼠腦SOD下降不明顯(P＞0.05),治療后C組較B組、E組明顯升高(P＜0.05)。MDA:與A組相比,B組胎鼠腦MDA明顯升高(P＜0.05);治療后各組MDA均有所下降,C組MDA明顯低于B組和D組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組胎鼠腦組織SOD和MDA比較(±s)

表1 各組胎鼠腦組織SOD和MDA比較(±s)

組別 SOD[U/(mg?prot)]MDA[nmol/(mg?prot)]A組 12.228±4.113 0.257±0.149 B組 7.019±2.899 0.684±0.2321)C組 17.450±6.0572)4) 0.153±0.0702)3)D組 10.561±3.468 0.343±0.134 E組 8.888±1.809 0.320±0.165與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與D組比較,3)P＜0.05;與E組比較,4)P＜0.05

3 討 論

香煙煙霧中的氧自由基可誘導不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應、蛋白質交聯和凝集。胚胎組織富含多不飽和脂肪酸,極易受到氧自由基的氧化損傷引起細胞凋亡。脂質過氧化物可引起細胞內Ca2+顯著升高,激活凋亡有關的蛋白(如蛋白磷酸酯堿酶、鈣神經堿等),導致 Bax升高,Bcl-2下調,從而誘導凋亡。香煙煙霧損傷胚胎腦神經元細胞的線粒體,導致線粒體內、外膜間的促凋亡因子細胞色素C和凋亡誘導因子釋放至胞漿中,通過一系列反應激活Caspase蛋白,引起細胞凋亡。六味地黃湯能降低Caspase-3的活化并抑制Bax升高,阻止凋亡的發生。

中醫理論認為生長發育、生殖和機體盛衰均由腎氣盛衰所主導。腎為先天之本,腎精是構成人體的基本物質,為生長發育提供原動力。腦為髓海,屬于奇恒之腑,為元神之所居。腎與腦的關系為“腎生髓,通于腦”,因此,腎在腦的發育中起著決定性的作用。腎之精氣的盛衰直接關系到腦髓的盈虧及大腦功能的正常發揮。腎中精氣不足,髓海失養就會形成健忘失眠,反應遲鈍,頭暈目眩,記憶力減退等髓海不足的病理變化,六味地黃丸可以改善上述病變。說明腎和腦之間有著密切的關系,本實驗進一步從現代醫學的角度反證了這一論斷。

課題組前期的研究已證實:孕鼠被動吸煙可造成胎鼠大腦皮質細胞層次不清,神經元凋亡增多,皮層神經元數量減少,顯示腦發育不良,六味地黃湯傳統飲片能有效改善上述表現[5]。本研究進一步表明:被動吸煙鼠仔腦組織中 Bax、Bcl-2和Caspase-3表達增加,六味地黃湯超微和傳統飲片均能抑制Caspase-3的活化和Bax升高;超微六味地黃湯全量組和超微六味地黃湯1/3劑量組對Caspase-3的效果優于傳統六味地黃湯組。

[1]Kelsey JL,Theodors RH,Bracken MB.Maternal smoking and congenital malfo rmations:An epidemiological study[J].J Epidem Community Health,1978,32:103.

[2]蔡光先,楊永華,張水寒.微粉化對人參類藥材有效成分的影響[J].中國醫藥學報,2001,16(6):26.

[3]蔡光先,楊永華,陳燕軍,等.銀翹解毒湯超微飲片與傳統飲片的化學對比研究[J].中國實驗方劑學雜志,2002,8(6):5.

[4]張秀泉,嚴雋鴻,洪素英,等.被動吸煙法建立IUGR動物模型[J].上海第二醫科大學學報,1993,13(4):314-317.

[5]蔡光先,劉柏炎,陳奕安.六味地黃湯對宮內發育遲緩胎鼠腦發育的影響[J].中華中醫藥雜志,2007,22(9):642-644.