針刺對高脂大鼠主動脈脂聯素受體基因表達的影響1)

袁愛紅,蔡 輝

脂聯素(adiponectin,APN)是白色脂肪組織分泌的細胞因子,對脈管系統有良性作用[1,2]。研究顯示,APN具有直接的抗動脈粥樣硬化的作用[3-8],對細胞間黏附分子-1、血管細胞間黏附分子-1和E選擇素等黏附分子的表達具有很強的抑制作用;能夠抑制巨噬細胞清道夫受體CA-1的表達,導致巨噬細胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)吸收明顯降低、抑制泡沫細胞的形成[6];能夠削弱平滑肌細胞中生長因子誘導的DNA合成[7],造成通過ERK信號轉導的抑制;APN的高聚體(HMW)形式通過激活AMPK能夠選擇性地抑制內皮細胞的凋亡[8]。APN與脂聯素受體(AdipoR)結合后發揮各項生理功能。研究發現,AdipoR1和AdipoR2在同組織同影響條件下表達有不同。為了探討AdipoR不同亞型在高脂飲食機體主動脈表達的變化以及針刺對該變化的影響,本研究采用實時熒光RT-PCR技術檢測了高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠主動脈AdipoR1和AdipoR2的基因表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 為剛斷乳的SD雄性大鼠26只,體重54 g～69 g,由南京軍區南京總醫院動物實驗中心提供[許可證號SYXK(蘇)2003-0032]。

1.2 實驗方法 所有SD大鼠均適應性喂養1周,根據體重隨機分為自配方高脂飼料組(17只)和普通飼料組(對照組,9只),喂養12周后,空腹過夜,球后靜脈取血 3 mL,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心5 min,分離血清置-20℃冰箱保存,測血脂四項、一氧化氮(NO)和髓過氧化物酶(M PO)。然后根據體重將高脂飼料組大鼠隨機分為模型組(8只)和針刺組(9只),干預 4周。針刺組:選取后三里、內庭、心俞三穴,進針后,每穴快速行針1 min,后三里和內庭接通G6805Ⅱ型電針儀連續波15 min,強度1 mA,頻率10 Hz。每次選取一側肢體,兩側輪流,周一到周六治療,周日休息,連續4周。實驗期間所有大鼠均自由攝食飲水,每周測1次身長、體重。

1.3 觀察指標和方法 實驗結束后,禁食24 h,于次日8:00用20%氯胺酮,以1 mL/100 g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,心臟取血5 mL,血液樣品處理同上,然后于冰盤中分離主動脈,置液氮中保存待測各項指標。三酰甘油(TG)用TPO-PAP法,總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法,NO用硝酸還原法,MPO用鄰連茴香胺法,主動脈AdipoR1和AdipoR2基因檢測用實時熒光RT-PCR法。

1.4 實時熒光RT-PCR步驟

1.4.1 RNA的提取 取主動脈組織100 mg,加入1 mLTrizol

1.5 統計學處理 干預前后比較用配對樣本t檢驗,多組資料組間比較用單因素方差分析,方差齊性用 LSD,方差不齊用Games-Howell。統計軟件用SPSS 15.0,計量資料以均數±標準差±s)表示。

2 結 果

2.1 針刺對高脂大鼠血脂的影響(見表1) 干預前,針刺組、模型組 TG、TC明顯高于對照組(P＜0.01),LDL-C高于對照組但無統計學意義(P＞0.05);模型組和針刺組TG、TC差異無統 計學意義(P＞0.05)。干預后,針刺組TG和TC明顯降低(P＜0.01),模型組、對照組干預前后TG和TC的差異無統計學意義(P＞0.05)。試劑,室溫下形成Trizol與細胞的混合液。將細胞裂解液轉至離心管中,室溫下放置5 min;12 000 r/min 4℃離心10 min,將上清液移入新離心管。加入氯仿,上下振蕩15 s,溶液呈乳白狀,室溫靜置3 min;12 000 r/min 4℃離心15 min;將無色上清水相移至另一離心管;上清水相中加入等體積的異丙醇,輕輕混勻,室溫靜置10 min;12 000 r/min 4℃離心10 min;去上清,沿管壁加入1 mL 75%的乙醇(用DEPC處理過的水配制),輕輕混勻。12 000 r/min 4℃離心10 min;吸盡上清;室溫干燥沉淀2 min～ 5 min,加入 30 μ L～ 50 μL的無 RNase水溶解 RNA 沉淀。測定樣品在260 nm/280 nm的吸收值確定RNA的質量。

1.4.2 反轉錄 每組份輕輕混勻,2 000 r/min離心20 s;取滅菌無核酸酶 0.2 mL PCR 管,依次加 入 2 μ g～ 5 μ g RNA 、Oligo dT(18)(10 μ mol/L)1 μ L、dNTPs(10 mmol/L)1 μ L 、無核 酸酶的雙蒸水至總體積 15.5 μ L;65℃保溫5 min,冰浴5 min;依次加入 RNase抑制劑 0.5 μ L、10×逆轉錄酶(AMV)Reaction Buffer 2 μ L、DTT 1μ L、AMV 1μ L,輕輕混勻后,2 000 r/min 離心20 s;37℃保溫1 h,70℃保溫15 min。

1.4.3 實時熒光PCR過程 一個樣本做3個復孔,用Eppendorf移液器移至AXygen96孔板中;反應體系為2X的RTmix 12.5μ L,模板(cDNA 稀釋 10 倍)1 μ L,引物 F 和 R 5 pmol/μ L mix 1 μ L,18.2 mΩ水 10.5 μ L,Total 25 μ L;PCR 程序為 95 ℃5 min,45cycle,94℃15 s,60℃30 s,95℃1 min,55℃1 min。

1.4.4 引物序列 AdipoR1:5'TGGGGAAAAAATTATGAACTGG 3',3'ACCCCTTT TTTAATACTTGACC 5';AdipoR2:5'AGTGATCCCTCATGATGTGCTG 3',3'TCACTAGGGAGTACTACACGAC5';內 參:5'GCAGAAGGAGATCACAGCCCT 3',3'CGTCTTCCTCTAGTGACGGGA 5'。

表1 各組干預前后大鼠血脂水平(±s) mmol/L

表1 各組干預前后大鼠血脂水平(±s) mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對照組 干預前 9 0.929 0±0.049 9 1.830 7±0.075 4 1.061 4±0.056 1 0.195 3±0.017 0干預后 9 0.797 9±0.065 0 1.690 1±0.105 9 0.990 6±0.081 1 0.153 3±0.016 7模型組 干預前 8 1.915 1±0.161 91) 3.483 9±0.406 51) 1.599 4±0.258 0 0.581 5±0.173 0干預后 8 1.533 7±0.060 8 3.083 7±0.347 9 1.502 3±0.181 8 0.458 9±0.096 1針刺組 干預前 9 1.744 0±0.078 11) 3.297 5±0.25 21) 1.627 0±0.311 6 0.253 3±0.052 6干預后 9 1.004 5±0.061 72) 2.017 0±0.113 32) 1.222 9±0.117 2 0.196 1±0.062 5與對照組干預前比較,1)P＜0.01;與同組干預前比較,2)P＜0.01

2.2 針刺對血清NO和MPO的影響(見表2) 干預前,模型組和針刺組NO明顯低于對照組(P＜0.01),M PO明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01),模型組和針刺組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。針刺后NO較前明顯增加,M PO較前明顯下降(P＜0.01),模型組干預前后比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 干預前后各組大鼠血清NO和MPO活力(±s)

表2 干預前后各組大鼠血清NO和MPO活力(±s)

組別 n NO(μ mol/L) MPO(U/L)對照組 干預前 9 23.076 9±1.138 7 42.281 2±2.549 4干預后 9 21.518 3±1.087 9 40.751 6±1.939 8模型組 干預前 8 13.579 6±1.124 72) 52.851 5±2.954 21)干預后 8 12.262 5±1.193 1 53.220 2±2.998 8針刺組 干預前 9 12.626 2±1.076 12) 51.677 1±1.538 32)干預后 9 17.345 4±1.805 23) 42.062 7±3.185 33)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與同組干預前比較,3)P＜0.05

2.3 針刺對主動脈AdipoR1和AdipoR2基因表達的影響(見表3) 針刺組、模型組AdipoR1、AdipoR2相對值低于對照組(P＜0.05或P＜0.01);針刺組AdipoR2相對值高于模型組(P＜0.05)。

表3 干預后各組大鼠主動脈AdipoR1和Adipo R2基因表達(±s)

表3 干預后各組大鼠主動脈AdipoR1和Adipo R2基因表達(±s)

組別 AdipoR1 mRNA AdipoR2 mRNA對照組 0.238 9±0.015 0 0.309 0±0.010 9模型組 0.060 8±0.001 31) 0.114 8±0.015 82)針刺組 0.088 6±0.014 52) 0.238 5±0.029 21)3)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05

3 討 論

APN是聯系腹內肥胖、代謝綜合征和心血管疾病的樞紐,同時也是脂肪細胞-血管調節軸上起關鍵作用的激素,與心血管疾病的發生發展密切相關。APN能夠抗血管生成[9]、抑制內皮炎癥反應和平滑肌細胞增殖[6],具有直接抗動脈硬化作用。目前對APN信號的研究是個熱點問題。AdipoR有AdipoR1和AdipoR2兩個亞型[10],兩者均為有7個跨膜區域的膜蛋白,有著相似的分子結構。AdipoR1是球形APN的高親和力受體,對于骨骼肌的長形APN親和力低,AdipoR2是肝臟球形和長形高分子量APN的中等親和力受體。在結扎冠狀動脈左前降支所致心肌缺血的小鼠模型中,梗死區和梗死邊緣區左心室肌AdipoR1 mRNA和蛋白表達均明顯降低[11],AdipoR2表達無明顯變化。PPAR α和 PPARγ激動劑可上調 3T3-L1脂肪細胞和參與動脈粥樣硬化形成的單核巨噬細胞的AdipoR2表達,對AdipoR 1表達無影響[12,13]。在非酒精性脂肪肝患者肝臟AdipoR2 mRNA水平顯著下調,AdipoR1 mRNA表達無明顯變化[14]。

疾病過程中AdipoR含量上調或下調及其活化狀態改變均可以引起細胞對APN的敏感性變化,從而影響細胞的代謝及功能,成為促進疾病發生與發展的重要機制之一。本研究顯示,高脂飲食飼養12周后,SD大鼠TG和TC明顯升高,發生了高脂血癥,血清中NO明顯降低,MPO明顯升高,血中NO濃度通常作為血管NO水平的標志[15],本實驗結果說明高脂大鼠機體氧化應激增強,血管功能受損;氧化應激是高脂造成血管內皮損傷的一個重要機制,APN對氧化應激具有抑制作用[16],反之,氧化應激亦可抑制APN表達。干預4周后,模型組大鼠主動脈AdipoR1和AdipoR2的基因表達明顯低于對照組,說明高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠主動脈APN信號受損,APN對主動脈的良性作用減弱;與模型組比較,針刺組大鼠TG、TC和MPO明顯降低,血清NO增加,主動脈AdipoR2基因表達明顯上調,AdipoR1基因表達無明顯變化,說明針刺具有一定的降血脂作用,與眾多文獻報道相符,同時針刺對于高脂機體血管功能的改善有一定的影響。此作用可能是通過針刺增加了主動脈的APN信號實現的,針刺對主動脈APN作用的改善可能是通過AdipoR2介導的。

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