利用蛋白質SDS-PAGE電泳方法檢測轉基因大豆的初步研究

金紅，孫琪，張斌，胡麗麗

（1.天津農學院農學系，天津300384；2.天津市食品研究所，天津301609）

利用蛋白質SDS-PAGE電泳方法檢測轉基因大豆的初步研究

金紅1，孫琪1，張斌2，胡麗麗1

（1.天津農學院農學系，天津300384；2.天津市食品研究所，天津301609）

為建立利用蛋白質檢測轉基因大豆的較穩定的新方法，采用SDS-PAGE蛋白質電泳方法對轉基因大豆和非轉基因大豆進行檢測，初步研究發現轉基因大豆中大約45 ku蛋白帶的表達量明顯強于非轉基因大豆中相對應的蛋白帶，通過固定轉基因大豆的上樣量，逐漸增加非轉基因大豆的上樣量進一步驗證了結果。以國內不同品種的非轉基因大豆進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，初步排除了結果偶然性的產生。

SDS-PAGE；轉基因大豆；非轉基因大豆

Abstract：In order to establish a new stable method of detecting genetically modified soybeans,genetically modified soybeans and non-genetically modified soybeans were tested by SDS-PAGE electrophoresis.It was found that the amount of the soybean protein with about 45 ku in genetically modified soybeans was more than that of non-genetically modified soybeans.The result was verified further by fixing the sampling volume of genetically modified soybeans and gradually increasing the sample volumes of non-genetically modified soybeans.And different species of non-genetically modified soybeans from the domestic were selected as control in order to exclude the accidence of the results.

Key words：SDS-PAGE；Genetically modified soybeans；Non-genetically modified soybeans

目前，轉基因植物的檢測主要以建立在DNA水平上的 PCR（polymerase chain reaction）方法為主[1]，但由于PCR組成體系復雜，參數較多，結果常常不穩定，易產生假陽性或假陰性現象。建立在蛋白質水平的酶聯免疫技術也曾在轉基因產品的檢測上起著一定作用，但需要有該蛋白質的抗體，使用上存在局限[2]。本研究從蛋白質是天然植物成分，利用SDS-PAGE方法，體系中外來影響因素少，檢測結果較穩定，重復性好的特點出發，目的在于找到能區別轉基因大豆和非轉基因大豆的蛋白質表達條帶，建立利用蛋白質檢測轉基因大豆的較穩定的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

轉基因大豆為天津農學院生物技術室保存，品系為美國轉基因大豆GST40-3-2。非轉基因大豆也為本室保存，品種分別為來自黑龍江大豆、W28544東北大豆、安盟大豆、長嶺大豆、得書大豆等。

1.1.2 藥品

標準分子量蛋白質：AR，鼎國生物技術公司；丙烯酰胺（Acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）：AR，Sigma公司。

1.1.3 儀器

臺式高速冷凍離心機（5147 R）：德國Eppendorf公司；小型電泳槽（Mini-PROTEAN3）及電泳儀（PowerpacHV）：美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 電泳方法

本研究采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳方法[3]，分離膠的濃度為12.5%。

1.2.2 蛋白質樣品的制備

分別稱取轉基因大豆與非轉基因大豆各0.1 g，置于研缽中，分別加入1 mL的無菌水充分研磨。然后將其分別倒入1.5 mL的離心管中，8000 r/min、4℃離心15 min，將上清液全部取出，加0.5 mL無菌水稀釋，混勻。各取上述稀釋好的樣品0.06 mL分別加入等體積的上樣緩沖液，充分混勻，于100℃水浴鍋中煮3 min~5 min，然后取出冷卻至室溫待用。

1.2.3 上樣和電泳

用帶平嘴針頭的0.01 mL的加樣器將同樣濃度的蛋白質樣品按不同體積加入到各上樣孔中，對照孔應加入蛋白質分子量標準物。電泳電壓最初應控制在59V，當樣品開始進入分離膠后，電壓加大至90 V，然后維持電壓不變，電泳時間約為3 h。考瑪斯亮藍R-250染色約50 min后退色過夜。用數碼照相機拍照記錄結果。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆與非轉基因大豆的SDS-PAGE電泳檢測

轉基因大豆與非轉基因大豆上樣量分別使用5、10、15 μL，標準分子量蛋白質為對照進行SDS-PAGE電泳，檢測結果如圖1。

由圖1可以看出，與非轉基因大豆品種B、D、F相比，轉基因大豆A、C、E在箭頭所指處均有一條帶的表達量明顯比非轉基因的強，經標準分子量蛋白質蛋白帶對比得知，這條帶的分子量大約為45 ku。考慮到非轉基因大豆的其他條帶也較轉基因大豆弱，所以接下來對研究進行調整。即固定轉基因大豆的上樣量（10 μL），逐漸增加非轉基因大豆的上樣量，以使轉基因與非轉基因兩者在其他條帶上的亮度一致，再看看有區別的45 ku的這個條帶是否仍然有區別，電泳檢測結果如圖2。由圖2可以看出，當轉基因大豆的上樣量一定時，增加非轉基因大豆的上樣量，仍然可以明顯地觀察到轉基因大豆中箭頭所指處有一條分子量約為45 ku的蛋白帶的表達量比非轉基因大豆的強，這進一步驗證了圖1所得出的結果。

2.2 不同品種非轉基因大豆蛋白質的電泳檢測

因為很難獲得GTS40-3-2原初品種，研究采用的非轉基因大豆是國內品種，為排除結果的偶然性，用更多非轉基因品種做對照，其結果見圖3。

由圖3可看出，上述6種非轉基因品種的各蛋白質電泳條帶的表達量沒有明顯的差異。

3 討論

3.1 SDS-PAGE蛋白的電泳檢測與PCR檢測方法的比較

表1將SDS-PAGE蛋白質電泳檢測與PCR檢測方法的特點進行了比較。從比較中可以看出利用SDSPAGE蛋白質電泳檢測非加工轉基因產品具有穩定性好的特點[4]。

表1 SDS-PAGE蛋白電泳檢測與PCR檢測的比較Table 1 The comparison of SDS-PAGE and PCR

3.2 轉基因產品檢測方法的發展趨勢

本研究中SDS-PAGE蛋白電泳方法是一種新的檢測趨勢，為轉基因產品的檢測提供了一個平臺，由于與轉基因大豆品種對應的非轉基因大豆品種無法引進，所以本研究只能搜集國內品種進行初步研究。以后的研究中，可以增加樣品和次數來進一步驗證。雖然，目前轉基因產品的檢測方法很多，但轉基因植物及產品的研究與產業化在帶來巨大經濟效益的同時，存在難以預測的安全問題對人們的生活引起了不容忽視的影響，所以，必須對轉基因作物種子實行嚴格的檢測、監測及監控，因此，有必要在現有基礎上探究更多更有效、更方便的檢測方法以便可以進行更加全面安全的檢測。另外，為了確保檢測結論的科學性和權威性以及為轉基因植物的標識管理提供更有力的證據，建議在以后的檢測中可以多種技術并用[5]。

4 結論

本研究著重探究SDS-PAGE蛋白電泳方法，從一個新的角度考慮，發現了轉基因大豆中有一條分子量約為45 ku的蛋白帶的表達量明顯比非轉基因大豆強，這樣，在蛋白質的檢測中，可以從表達量的大小來區分轉基因大豆與非轉基因大豆。另外，在以后的研究中，應該進一步探索其差異量的大小，將該蛋白質條帶回收出來，考察其來源，讓SDS-PAGE蛋白質電泳方法邁上一個更高的臺階。

[1]楊洋，吳春蘭.國內外轉基因食品現狀及其安全管理[J].食品工業科技,2004(4):118-121

[2]雷勃鈞,單紅,呂曉波,等.PCR-ELISA法對大豆品種的轉基因定性檢測研究[J].大豆科學,2004,23(4):55-58

[3]張云貴,劉祥云,李天俊,等.生物化學實驗指導[M].北京:中國農業出版社,2007:74-77

[4]武泰存,王景安.用PCR和SDS-PAGE兩種方法對轉基因大豆的檢測[J].生命科學研究,2005,9(1):011-014

[5]楊少輝,張麗娟,馬峙英,等.轉基因作物商品化生產進程中面臨的問題和展望[J].河北農業大學學報,2002,增刊(1)：4

The Preliminary Study on Detecting Transgenic Soybeans by Protein SDS-PAGE Method

JIN Hong1,SUN Qi1,ZHANG Bin2,HU Li-li1
（1.Dept.of Agronomy of Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2.Food Institute of Tianjin，Tianjin 301609，China）

2009-03-04

天津農學院大學生創新基金項目（2008-C-01）

金紅(1967—)，女（漢），研究員，碩士，主要從事生物化學教學與生物技術研究。