大白菜溫度敏感雄性不育育性轉化相關XET基因的電子克隆

張少麗 張魯剛 張明科 惠麥俠

（1西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100；2甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

大白菜溫度敏感雄性不育育性轉化相關XET基因的電子克隆

張少麗1，2張魯剛1*張明科1惠麥俠1

（1西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100；2甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

以從大白菜溫敏雄性育性轉化相關基因差異表達的分析中獲得的 EST-58為標簽，采用電子克隆的方法對其進行延伸，并對電子克隆的結果進行RT-PCR驗證，結果表明:電子克隆到1個由1197 bp核苷酸組成的序列，該序列具有完整的開放閱讀框架（ORF），編碼蛋白為292個氨基酸。經RT-PCR擴增，連續樣品間EST-58表達的帶型變化趨勢與cDNA-AFLP的差異顯示情況一致，且RT-PCR獲得的序列與電子克隆的序列一致性達98 %。用該序列在GenBank數據庫中進行blastX同源性分析，確定該序列為大白菜的XET基因（GenBank登陸號為EU579461）。

大白菜；育性轉化；木葡聚糖內糖基轉移酶基因（XET）；電子克隆

全基因組測序并不是發現基因最有效的方法，因為基因組中只有2 %的序列編碼蛋白質（李剛 等，2000）。作為cDNA部分序列的表達序列標簽（Expressed sequence tags，ESTs）已成為尋找未知功能新基因及克隆不同時空差異表達基因的重要途徑（李曉曉 等，2007）。通過mRNA差異顯示、代表性差異分析或cDNA-AFLP等方法獲得ESTs后，研究者們都迫切希望迅速克隆到其全長cDNA序列，以便對該基因的功能進行研究（李剛 等，2000）。電子克隆（In silico cloning）策略是近年來隨著基因組計劃和EST計劃的發展而興起的一門快速克隆基因部分乃至全長的新技術（Gill & Sanseau，2000）。由于受到DNA序列資源的限制，該技術在植物中的應用還比較少（李曉曉 等，2007）。

本試驗在大白菜〔Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson〕TsCMS7311育性轉化cDNA-AFLP研究的基礎上（張少麗 等，2008），采用電子克隆的方法，對獲得的大白菜TsCMS7311育性轉化相關的表達序列標簽EST-58進行序列延伸，并采用RT-PCR進行驗證，利用生物信息學的方法將該序列與GenBank數據庫中的同源蛋白進行比對分析，得到大白菜XET基因的cDNA序列（GenBank登陸號為EU579461），為進一步的功能及其與TsCMS7311育性轉化關系的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大白菜溫度敏感不育系（TsCMS7311）由西北農林科技大學園藝學院白菜研究室選育并提供，該不育系對溫度敏感，屬于低溫可育類型，現蕾期經低溫處理，育性可發生轉換（Zhang & Hao，2001）。

1.2 電子克隆的生物信息學策略及相關數據庫

利用EST數據庫進行核酸序列電子克隆的基本思路（張成崗和賀福初，2002）:① 利用序列同源性比較軟件（如Blast軟件）將種子序列（待進行電子延伸的序列）對庫檢索；② 從數據庫中挑選出全部相關序列；③ 對所有序列進行片段整合分析（即Contig分析），形成新生序列（延伸后的序列）。隨后，將此新生序列作為種子序列重復進行上述三步過程，直至新生序列不能夠被進一步延伸為止。

所用數據庫和軟件包括:NCBI的GenBank數據庫，NCBI網站的同源性分析程序BLAST及ORF Finder查詢器，EST組裝軟件CAP3，序列編輯及校對軟件BioEdit，序列的多重比較及系統進化樹分析軟件DNAMAN等。

1.3 克隆方法

1.3.1 質粒、菌株 質粒PMD18-T載體購自TaKaRa公司。菌株E. coli DH5α由農業部西北園藝植物種質資源與遺傳改良重點開放實驗室保存。

1.3.2 樣品準備、RNA提取及雙鏈 cDNA的合成 將室溫（24 ℃左右）條件下生長的剛現蕾的大白菜不育系置于溫度7 ℃左右、光照強度3000 lx的培養箱中處理9 d（Zhang & Hao，2001），然后將培養箱溫度調至24 ℃繼續培養。從處理的第5天開始取樣，每天相同時間取≤1.0 mm的花蕾（包括生長點），共取樣10次。

總RNA的提取采用博日生物技術公司生產的Bizol試劑盒，提取方法參照說明書進行。總RNA中的痕量 DNA用 RQDNaseⅠ（TaKaRa公司，大連）進行純化。cDNA第一鏈的合成采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司，大連）進行，第二鏈的合成使用DNA polymeraseⅠ和RNase（TaKaRa公司，大連），具體操作依照試劑說明書進行。雙鏈cDNA用苯酚/氯仿/異戊醇（25 V∶24 V∶1 V）溶液純化后溶于10～20 μL的ddH2O中，備用。

1.3.3 引物合成 根據電子克隆所得到的序列運用OLIGO6.0結合PRIMER5.0引物設計軟件，設計引物:5’引物:5’-TTTGCGGATGACTTTAGG-3’；3’引物:5’-TCCCACCAGTTCTTTGGATTAG-3’；預擴區間（170～812 bp）。

1.3.4 PCR反應及片段回收測序 將提取的各時期RNA采用RT-PCR方法進行擴增，擴增完畢于1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳分析，切取目的片段并利用凝膠回收試劑盒（TiANgel Midi Purification Kit）進行回收純化。純化了的DNA連接pMD18-T載體（TaKaRa公司，大連），轉化感受態大腸桿菌DH5α并進行克隆，經PCR檢測后將陽性克隆送于生工生物工程（上海）有限公司采用M13正向、反向引物進行測序。

2 結果與分析

2.1 電子克隆結果

首先以表達序列標簽EST-58為種子序列，利用Blast軟件對GenBank數據庫檢索；獲得與木葡聚糖內糖基轉移酶基因（XET）相似性較高的序列組 EST-58—Bra5050（EST-58代表種子序列編號，Bra5050代表GenBank數據庫中UniGene的編號），包含14個相關序列標簽（ESTs），這14個 ESTs均來自蕓薹屬的大白菜，登錄號分別為:CV433160、DN960868、DN961282、DN965906、EX028596、EX059229、EX076694、EX077722、EX079287、EX080597、EX082503、EX096959、EX117429、EX141348。將這些相關序列下載并用組裝軟件CAP3進行組裝，得到一個新生contig序列；將此contig序列用BioEdit軟件進行編輯和校對，最終得到長為1197 bp的新生序列（圖1）。

圖1 大白菜EST-58電子克隆結果的閱讀框架分析

2.2 RT-PCR驗證

根據電子克隆的結果設計特異引物，以大白菜10個時期的微蕾cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析的結果顯示（圖2），得到的片段與預計大小相符。另外，條帶在圖2中的表現與最初的cDNA-AFLP的差異顯示（圖3）情況一致，即1、9、10樣品中帶很弱，其他樣品條帶很亮（6樣品的cDNA可能發生了降解），帶型趨勢為:無→有→無。進一步說明得到的XET序列確實與溫敏大白菜育性的轉化有關。低溫處理5 d時，由于所取樣品的部分花芽分化于常溫生長時已完成，這時花的育性轉化不徹底，表現出嵌合態，大白菜XET基因轉錄很弱（圖2、3的1泳道）；經低溫誘導后，雄蕊育性轉化徹底，呈完全可育狀態，該基因轉錄增強（圖2、3的2～8泳道），其中6～8泳道（第10～12天取樣）為溫度調至24 ℃時所取樣品的譜帶，此時雖然溫度升高，但由于幼蕾花芽分化在低溫時已形成，所以育性仍表現可育；當育性再次回復到不育狀態時（溫度調至24 ℃的第4～5天），基因的轉錄也隨之減弱（圖2、3的9～10泳道）。

用pMD18-T載體克隆后測序，得到長度為643 bp的序列，該序列與電子克隆結果相似性分析表明:兩者序列基本相符，一致性達98 %（圖4）。由此可斷定電子克隆結果是真實存在的。

圖2 大白菜EST-58電子克隆結果的RT-PCR驗證

圖3 EST-58片段在10個樣品中的 cDNA-AFLP差異顯示結果

圖4 RT-PCR序列測定結果與電子克隆結果一致性比較

2.3 將RT-PCR擴增序列替代電子克隆結果的相應序列后進行閱讀框分析

應用NCBI的ORFfinder工具在所得序列中查找開放閱讀框（圖1）。該閱讀框編碼292個氨基酸，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。-3位為A，+4位為G，符合Kozak規律，3’端有polA尾，說明該讀碼框是完整的。

2.4 序列同源性分析

將RT-PCR測得的序列結合電子克隆結果，在GenBank中進行氨基酸同源性分析，結果表明:得到的大白菜（B. pekinensis）XET與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉（Gossypium hirsutum）、雜種大丁草（Gerbera）、雜種山楊（Populus tremula）、波旁月季（Rosa borboniana）、截形苜蓿（Medicago truncatula）、番茄（Lycopersicon esculentum）、香蕉（Musa acuminata）、日本柳杉（Cryptomeria japonica）的木葡聚糖內糖基轉移酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）有著很高的氨基酸序列一致性。氨基酸序列長度也基本相同，進一步證實所得序列為一個完整的基因。從同源蛋白檢索的結果中并未發現有大白菜XET序列的報道，說明EST-58延伸得到的完整序列是大白菜中的一個新基因，即大白菜XET基因。另外，不同植物間XET氨基酸序列的N-端差異很大，而C-端具有較高的保守性。

從構建的XET系統進化樹中可以看出（圖5），大白菜 XET與同為十字花科的擬南芥的一致性最高，達到94 %；而與大白菜親緣關系較遠的物種如日本柳杉、雜種山楊等也有較高的相似性，說明XET基因保守性很強。

圖5 木葡聚糖內糖基轉移酶系統發育樹

3 結論與討論

與傳統獲得基因全長的RACE技術及全長cDNA文庫篩選等方法相比，電子克隆技術具有高效、快速、成本低、針對性強等優點。本試驗利用此技術對大白菜XETcDNA序列進行了成功的克隆。但由于dbEST中EST數據不夠精確，精確度最高為97 %，所以獲得的序列只是一種模擬序列，其真實性還需要RT-PCR驗證。為了提高電子克隆的準確性，在實際操作中應注意，將種子序列進行同源檢索、連接時，應盡量選擇親緣關系近的物種，以避免序列的錯誤連接。

用特異引物進行RT-PCR擴增、克隆得到長642 bp的序列，該序列與電子延伸相應序列一致性達98 %，這可能是由物種間基因的差異或是dbEST中EST數據的不準確性造成的。在進行同源比較分析基因功能時，蛋白質序列之間在至少80個氨基酸左右的區域中具有25 %同源性，就可提示其功能的相似性（張成崗和賀福初，2002）。本試驗所得cDNA序列同源蛋白分析顯示，其與擬南芥XET全序列（293 aa）的一致性高達94 %，故可以斷定該序列對應的蛋白為大白菜木葡聚糖內糖基轉移酶（XET）蛋白。

木葡聚糖是雙子葉植物細胞初生壁的主要半纖維素多糖，它緊密地結合到纖維素的微纖絲上，并通過束縛相鄰的微纖絲，對細胞壁的膨脹起限制作用。木葡聚糖/微纖絲的網絡結構是維持植物細胞初生壁伸展性和強度所必須的，XET可以改變木葡聚糖/微纖絲的網絡結構，導致細胞壁松弛和細胞擴展。所以說XET是一類重要且與細胞伸長密切相關的細胞壁松弛酶，它對細胞壁的膨脹疏松及在細胞壁重建中發揮著重要作用（王旭靜 等，2005；朱明月 等，2005；趙云峰 等，2006）。XET不僅具有木葡聚糖內糖基轉移作用，而且還具有解聚和水解的功能，XET在果實成熟衰老過程中的作用首先是使連接纖維素微纖絲間的木葡聚糖鏈解聚，進而使木葡聚糖鏈發生不可逆的破裂（趙云峰 等，2006）。XET在細胞伸長過程中扮演著重要角色，它調節著細胞壁成分——木葡聚糖/微纖絲的網絡結構，其活性與細胞、組織的伸長呈正相關（王旭靜 等，2005）。細胞壁重建、改組在植物整個生命過程中占有一定的地位，它對細胞的形態、結構、功能起著重要的作用。低溫誘導后大白菜花蕾的XET活性增強，孢母細胞壁組建正常，雄蕊育性表現正常；反之，則不能形成正常花粉粒。至于溫度如何誘導XET基因，而XET基因在大白菜育性轉化中又起什么樣的作用，有待進一步研究。

李剛，胡迎春，張開泰，吳德昌.2000.“電子”cDNA文庫篩選指導基因的全長cDNA克隆.生物技術通訊，11（1）:1-4.

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In silico Cloning of Xyloglucan Endotransglycosylase（XET）Gene Related to Fertility Changeover in the Thermo-sensitive Chinese Cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）

ZHANG Shao-li1,2, ZHANG Lu-gang1*, ZHANG Ming-ke1, HUI Mai-xia1
（1College of Horticulture, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling712100, Shaanxi, China;2Vegetables Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou730070, Gansu, China）

The EST-58 related to the fertility changeover in the thermo-sensitive CMS（TsCMS7311）of Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）was amplified by in silico cloning. And the cDNA sequence had been confirmed by RT-PCR. The result indicated that a new sequence with1197 bp length was cloned，which contained an integrated ORF, encoding292 amino acids.The trend of EST-58 expression by RT-PCR was very identity to the expression by cDNA-AFLP, and their sequences have98 % consistency. As showed that the result of in silico cloning was right. The amino acid sequence showed highly comparability with xyloglucan endotransglycosylase（XET）fromgenBank. It indicated that the new sequence was XET gene（GenBank accession, EU579461）of Chinese cabbage.

Chinese cabbage; Fertility changeover; Gene of xyloglucan endotransglycosylase（XET）; In silico cloning

Q785

A

1000-6346（2010）24-0019-06

2010-09-16；接受日期:2010-10-09

國家自然科學基金（30871717），國家科技支撐計劃（2009BADB8B03）

張少麗，女，博士，助理研究員，專業方向:蔬菜育種，E-mail:shanpengzsl@yahoo.com.cn

*通訊作者（Corresponding author）:張魯剛，男，博士，教授，專業方向:蔬菜種植資源與育種，E-mail:lugangzh@163.com