楊梅葉提取物抑菌活性初步研究

李 橋，楊小豐，張紹勇，張 旭，陳安良

(1.浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300;2.浙江省湖州市新農(nóng)村建設(shè)研究中心，浙江 湖州 313000)

植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的一部分，其開發(fā)研究一直是新農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)課題之一［1］。楊梅(Myrica rubra)屬楊梅科、楊梅屬果樹，多年生常綠喬木，為我國特產(chǎn)。楊梅葉是可以快速生長的再生資源，資源豐富。對楊梅葉的研究目前主要集中在2個方面:一是對其中化學(xué)成分的研究［2－6］;二是楊梅葉提取物的抑菌活性研究。胡靜麗［7］測定了楊梅葉乙醇提取物對食品常見污染菌的抑制效果，結(jié)果顯示，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌革蘭氏陽性菌以及對食品中常見腐敗菌如橘青霉、圓弧青霉和黑曲霉效果較好。陳蓉蓉等［8］用矮楊梅葉水煎物作了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，對G+金黃色葡萄球菌有抑制作用。沈建國等［9］用楊梅葉提取物進(jìn)行了抗煙草花葉病毒的研究，結(jié)果表明，具有較強(qiáng)的體外鈍化和抗病毒侵染作用。夏其樂等［10］研究了楊梅葉提取物的抗氧化活性，結(jié)果顯示，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。劉洪波等［11］采用菌絲生長速率法測定了楊梅葉粗提物對6種常見植物病原菌的抑制活性，結(jié)果表明，楊梅葉丙酮提取物對常見植物病原菌有較高的抑制作用。我們采用菌絲生長速率法測定楊梅葉甲醇浸膏的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4個萃取相對農(nóng)業(yè)上常見的植物病害病原菌的抑菌作用，旨在為尋找楊梅葉中抑菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用楊梅葉，2008年7月采于浙江林學(xué)院校園內(nèi)，室溫下自然風(fēng)干，粉碎，過40目篩 (孔徑0.37 mm)，密封，置于冰箱中 (0～4℃)備用。

1.2 植物病原菌

植物病原菌，番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)，番茄早疫病菌 (Altemaria solani)，水稻紋枯病菌 (Rhizoctoniasolani)，小麥赤霉病菌(Fusaiumgraminearum)，黃瓜炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)，玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)，均由浙江林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

化學(xué)試劑，甲醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.3 提取

取1.1節(jié)所得樣品2 kg，在室溫下用甲醇浸提3次，浸提時(shí)間分別為24，24，48 h，每次浸提后再超聲提取45 min，合并提取液，減壓濃縮得浸膏356.85 g。將浸膏300.00 g加去離子水800 mL混勻得懸濁液，分別用等量的石油醚 (60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每種溶劑萃取3次，濃縮至膏狀，得石油醚相19.93 g、氯仿相14.81乙酸乙酯相18.46 g、正丁醇相28.26 g。

1.4 抑菌活性測定

1.4.1 不同溶劑萃取相毒力測定方法

采用菌絲生長速率法測定楊梅葉各萃取相對供試植物病原菌的抑制作用。將各萃取相用丙酮溶解，再配制含各萃取相質(zhì)量濃度10 g·L－1的PDA培養(yǎng)基，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，對照為丙酮。每處理設(shè)4個重復(fù)，向上述各培養(yǎng)基中接入生長旺盛的直徑為5 mm的病原菌菌餅，每皿1塊。將接好菌的培養(yǎng)基用保鮮膜密封，置于25℃條件下培養(yǎng)，待空白對照菌絲長滿培養(yǎng)皿后，采用十字交叉法測量各自的菌落直徑。菌絲生長抑制率計(jì)算公式:抑制率 (%)=(對照菌落直徑 －處理菌落直徑) ×100/對照菌落直徑。菌落直徑 (cm)=測量菌落直徑平均值－0.5。0.5為菌餅直徑。

1.4.2 乙酸乙酯、正丁醇萃取相精密毒力測定

測定方法同1.4.1節(jié)，用丙酮溶解楊梅葉乙酸乙酯和正丁醇萃取相，再配制不同濃度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各萃取相濃度為 1，5，10，20 g·L－1，供試菌為玉米大斑病、番茄灰霉病、水稻紋枯病、小麥赤霉病等4種。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取相對病原菌菌絲生長的抑制作用

楊梅葉不同溶劑萃取相對供試植物病原菌菌絲生長的抑制作用見表1。在10 g· L－1濃度下，各萃取相之間對多數(shù)供試病原菌抑菌作用差異較大。其中乙酸乙酯相總體抑菌效果最好，其對番茄早疫病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和黃瓜炭疽病菌的抑制效果均為最好，抑制率依次為62.61%，73.33%，59.44%和49.31%;正丁醇相抑制效果次之，其對番茄灰霉病菌和玉米大斑病菌的抑制率最高，抑制率分別為81.52%和72.12;石油醚相的抑菌作用最差。

表1 不同溶劑萃取相對供試植物病原菌菌絲生長的抑制作用

2.2 乙酸乙酯、正丁醇萃取相對病原菌的毒力

表2、3可見。楊梅葉乙酸乙酯萃取相對4種供試病原菌的毒力差異不大，EC50最大值與最小值之間的差值為3.21 g·L－1。乙酸乙酯萃取物對水稻紋枯病的毒力最強(qiáng)，EC50為2.21 g·L－1，對玉米大斑病菌的毒力次之，EC50為3.32 g·L－1;對小麥赤霉病菌的毒力最弱，EC50為5.42 g·L－1。

表2 楊梅葉乙酸乙酯萃取相對供試病原菌的毒力

表3 楊梅葉正丁醇萃取相對供試病原菌的毒力

楊梅葉正丁醇萃取相對番茄灰霉病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為0.88 g·L－1;對玉米大斑病菌的毒力次之，EC50為1.92 g·L－1;對小麥赤霉病菌的毒力最弱，EC50為 9.22 g·L－1。

3 小結(jié)和討論

楊梅葉中含有多種黃酮類化合物［2］，黃酮類化合物具有廣泛生物活性［12］，而乙酸乙酯可以萃取出黃酮類化合物，因此本試驗(yàn)中乙酸乙酯對各種供試菌的活性很可能是其中黃酮類化合物的抑菌作用。此外，正丁醇相也具有良好的抑菌作用，說明楊梅葉中除黃酮類化合物之外還有其它類型抑菌活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)只研究了楊梅葉乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相對供試菌的菌絲生長速率的抑制活性，并且只對幾種供試菌種的毒力進(jìn)行了測試，尚未進(jìn)行盆裁藥效試驗(yàn)。下一步將進(jìn)行活體和室外試驗(yàn)，并擴(kuò)大供試菌種范圍，以確定楊梅葉提取物的殺菌譜，為以后的防治工作提供參考。

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