凍融循環對甲殼素溶解性的影響

劉廷國，李 斌，宋 雪，陸志敏，王瑞俠，汪 新

(1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070;2.池州學院化學與食品科學系，安徽池州247100)

凍融循環對甲殼素溶解性的影響

劉廷國1，2，李 斌1，*，宋 雪1，陸志敏2，王瑞俠2，汪 新2

(1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070;2.池州學院化學與食品科學系，安徽池州247100)

甲殼素具有許多獨特的性質，但不能溶于常規溶劑，極大地限制了其廣泛應用，提高其溶解性成為迫切需要解決的問題。對甲殼素和濃NaOH混合物進行反復凍融處理，慢速冷凍/低溫解凍的凍融循環處理過程中冰晶的反復形成和重結晶作用，能夠破壞甲殼素凝聚態特別是晶態結構，促使甲殼素溶于一定濃度的NaOH溶液中。探討了凍融次數、冷凍溫度、NaOH濃度和甲殼素與溶劑的比例分別對溶解性的影響。結果表明，－18℃、40%NaOH(甲殼素∶水=1∶4，W/V)經過3次凍融循環處理，可以形成均一、透明的甲殼素均相溶液，甲殼素終濃度約為4%，NaOH終濃度約為10%，為用均相脫乙酰法制備半脫乙酰水溶性甲殼素提供前提。結果表明，凍融循環處理能顯著降低甲殼素分子內和分子間強氫鍵相互作用，破壞甲殼素分子致密的晶體結構，使分子結構紊亂，從而為制備水溶性甲殼素提供了可能。

甲殼素，循環凍融，氫鍵，晶體結構

Abstract:Due to the special chemical structure，chitin had many unique properties.However，it was insoluble in water，diluted acid，alkaline solution and common organic solvents.This was the major problem that confronted the application of chitin，hence it was an urgent need to resolve how to improve the poor solubility of chitin.This paper explored the effects of freezing－thawing cyclic(FTC)treatment on the solubility in alkaline solution and condensed state structure of chitin.The mixture of chitin and concentrated NaOH solutions was freezed and thawed，repeatedly.With slowly freezing and low temperature thawing cycle process that could destruct the condensed matter especially the crystalline state structure more thoroughly，because of the ice crystals’repeatedly formed and recrystallizated.Therefore，chitin could dissolve in a certain concentration diluted NaOH after some times of FTC treatment.Effects of FTC times，freezing temperature，NaOH concentration and the ratio of chitin and water on the solubility of chitin were investigated.The results showed that via three times of FTC treatment at－18℃ with NaOH concentration of 40%(the ratio of chitin and water was 1∶4，W/V)，chitin could be completely dissolved in NaOH aqueous solution and formed a limpidity homogeneous solution with a chitin concentration about 4%(W/W)and a final NaOH concentration of approximately 10%(W/W)，which was possible to prepare partial N－deacetylated water－soluble－chitin.The results indicated that the formation and growth of ice crystal in the slowly freezing process could break the intra－and/or inter－molecular hydrogen bonds interaction，and destruct the compact crystal structure and decline the crystallinity of chitin，it could also disorder the ordered molecular structure，which might be used to prepare water－soluble－chitin.

Key words:chitin;freezing－thawing cyclic treatment;hydrogen bonds;crystalline structure

甲殼素是迄今為止發現的唯一大量存在的天然堿性多糖，也是除蛋白質外數量最大的天然含氮有機化合物，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲的甲殼，軟體動物的殼和外骨骼以及某些真菌的細胞壁中，每年自然界生物合成量將近100億t，是僅次于纖維素的天然可再生資源［1－2］。由性質活潑的伯胺基取代了化學惰性的乙酰氨基，這賦予殼聚糖許多獨一無二的性質:良好的生物相容性、廣譜抗菌性、生物可降解性、重金屬離子螯合性、成膜性和成纖維性等［3－4］。使甲殼素、殼聚糖及其衍生物在生物醫用材料、廢水處理、紡織印染、食品、化妝品和農業等領域均有很高的應用價值［5－6］。殼聚糖存在大量親水基團，很容易吸附水分子，對材料的結構和性能影響很大［7］，限制了其在材料領域的廣泛應用。而分子內、分子間強氫鍵相互作用的存在，致使甲殼素不溶于水、稀酸、稀堿、濃堿和一般有機溶劑，濃硫酸、鹽酸、磷酸和無水甲酸可使其溶解，但同時嚴重降解其分子鏈［8］。因此，提高甲殼素溶解性，尋找對其結構影響小，溶液性質穩定的良溶劑成為近年科學家廣泛關注的熱點之一［9－10］。在反復凍融過程中，冰晶的存在和生長，會不同程度地對碳水化合物高聚物微觀結構造成機械損傷［11－12］。對堿甲殼素進行凍融循環(freezingthawing cyclic，FTC)處理，制備出一種高濃度甲殼素均相溶液。通過研究凍融參數對溶解性的影響，為探索廉價、方便的甲殼素良溶劑提供一種新思路，為FTC法在碳水化合物加工中的廣泛應用積累理論和實踐經驗，也為甲殼素在更大范圍內的廣泛應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素 食品級，脫乙酰度21.11%，過80目篩，浙江金殼生物化學有限公司;實驗用水 均為雙蒸水;化學試劑 均為分析純。

冰柜 BC/BD－190S，控溫范圍4～－37℃，上下波動0.5℃，青島海爾特種電冰柜有限公司;數字旋轉粘度計 NDJ－8S，上海精密科學儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋 HH－4，國華電器有限公司;真空干燥箱 DZF－6050，上海精宏實驗設備有限公司;冷凍離心機 BC－010TY2265，美國Beckman公司;分析天平 AC2105，德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿甲殼素凍融循環處理 甲殼素粉末與40%濃度NaOH溶液(甲殼素∶水=1∶4，W/V)充分混勻，密封后室溫放置8h，使甲殼素顆粒充分浸潤，－18℃分別冷凍處理1～6d，每個樣品做三個平行。每天將樣品從－18℃冰箱取出，40℃恒溫水浴解凍，樣品中心溫度升至40℃時取出重新冷凍。處理結束的樣品用蒸餾水稀釋至甲殼素終濃度為4%。樣品溶液于4℃、10000r/min離心20min，收集上清液。不溶物依次用10%NaOH溶液、1mol/L稀鹽酸溶液、蒸餾水、70%(V/V)乙醇、95%乙醇洗滌，直至用0.1mol/L AgNO3檢測不含Cl－，60℃真空干燥后準確稱重，甲殼素溶解性(Solubility，S，%)按下式計算:

式中:W0為原始甲殼素質量，g;W1為不溶的甲殼素質量，g。

分別考察堿濃度、冷凍溫度以及原料與溶劑之比對甲殼素－堿混合物經過3次凍融循環后溶解性的影響。

1.2.2 堿甲殼素溶液穩定性 甲殼素與40%濃度NaOH混合物經過2次FTC處理，用水稀釋甲殼素終濃度為4%，NaOH終濃度約為10%，樣品溶液于4℃、10000r/min離心20min，收集上清液。恒溫放置，每隔一定時間，取一定量上清液傾入專用測量杯中，用NDJ－8S數顯粘度計(4號轉子，12r/min)測量樣品溶液表觀粘度，每次測三個平行取平均值。

2 結果與討論

2.1 凍融循環處理對甲殼素溶解性的影響

由于甲殼素的分子結構高度有序，不溶于酸、堿和一般有機溶劑，限制了其在醫藥衛生、生物工程等領域的廣泛應用，因此，提高甲殼素的溶解性是科學家普遍關注的熱點問題之一。目前研究較多的是強氫鍵開裂劑，如鹵代醇、鹵代醇/酸、酰胺/氯化鋰以及尿素/強堿溶液等［1］。

甲殼素N－乙酰葡萄糖殘基上的活性羥基，雖比小分子醇羥基的反應活性小得多，但仍然能夠與強堿溶液發生取代反應，生成堿甲殼素。1940年Thor等人將甲殼素分散到20倍體積的43%NaOH溶液中，最早制備了鈉甲殼素［1］。1975年Sannan等人報道，將3g甲殼素與75g強堿溶液(含NaOH 30g)混合并真空脫氣，添加225g碎冰在低于0℃的低溫條件下強烈攪拌可以制備甲殼素濃度約為1%，NaOH濃度約為10%的甲殼素均相溶液［13］。Einbu等人用同樣的方法制備了甲殼素終濃度為0.225%，NaOH濃度為10%的甲殼素溶液，并研究了其溶液性質，證明強堿溶液是甲殼素的優良溶劑［14］。Hu等人首次報道8%NaOH/4%尿素溶液也可以作為甲殼素的優良溶劑，不但可以得到穩定的溶液，而且對甲殼素的固體結構影響極?。?5］。然而，此前的研究只能制備甲殼素的稀溶液，不利于采用均相脫乙酰法批量制備水溶性甲殼素;而且后續處理繁瑣、冗長，需要消耗大量有機試劑，不但浪費而且容易造成二次污染。

圖1 凍融次數對甲殼素在堿溶液中溶解性的影響

2.1.1 凍融次數對甲殼素溶解性的影響 圖1給出了經過循環凍融處理的甲殼素在堿溶液中的溶解性變化情況。溶解性總體趨勢上隨處理時間的延長而增大。在最初3d溶解性隨處理時間延長迅速增加，第3d甲殼素在堿溶液中的溶解性已經超過95%，此后繼續處理溶解性幾乎不變。這說明在凍融處理后期，NaOH向甲殼素顆粒內部滲透阻力增大，對分子結構的破壞作用減小，溶解性變化不明顯，從經濟學與周期性角度考慮凍融3d是較佳選擇。經過3d處理即能得到均一、透明的甲殼素溶液，甲殼素終濃度約為4%，NaOH終濃度為10%。與文獻［13］報道相比，甲殼素濃度提高了4倍，制備相同濃度的堿甲殼素溶液NaOH用量降低到原來的1/4，極大降低了堿的用量，而且克服了文獻報道方法由于甲殼素溶液濃度低［13－14］，溶劑體系復雜［15］，導致后處理冗長、繁瑣、需消耗大量有機溶劑的缺點，可以部分緩解環境污染。

2.1.2 NaOH濃度對甲殼素溶解性的影響 在NaOH溶液作用下，甲殼素分子一方面脫去乙?；?，轉變為分子中含氨基的殼聚糖;另一方面，C6位－OH與NaOH發生成鹽反應，形成鈉甲殼素，從而可以溶于氫氧化鈉溶液。圖2描述了不同NaOH濃度對甲殼素溶解性的影響。由圖中數據可知，甲殼素在10%、20%NaOH作用下幾乎未溶解;而NaOH濃度在20%和30%之間時，溶解度隨著NaOH濃度的升高而迅速增大;當NaOH的濃度大于40%時，溶解度又隨之減小。這可能是因為:當NaOH含量太低時，OH－的含量不能滿足甲殼素脫乙酰胺基的含量要求;而且滲透性不強，不足以破壞甲殼素致密的晶體結構，因此難于溶解。NaOH濃度超過30%后，已經可以滿足脫乙酰反應對NaOH濃度的需要，另外也有較強滲透性，可以大幅度破壞甲殼素晶體結構，提高溶解性，但是再增加NaOH濃度并不能提高樣品溶解性，前期研究工作已經表明純粹通過提高堿濃度來加速脫乙酰反應進程并不現實［16］，出于經濟實用角度考慮，在凍融循環條件下，30%～40%NaOH是最佳的工業選擇。

圖2 NaOH濃度對甲殼素在堿溶液中溶解性的影響

2.1.3 冷凍溫度對甲殼素溶解性的影響 冷凍溫度對甲殼素溶解性也有著極顯著影響。如圖3所示，－18℃和－25℃時溶解性最高，超過90%，隨著溫度升高或降低，溶解性變化不明顯，維持在60%～70%，這主要與凍融引起甲殼素溶解的機理有關。在反復冷凍和低溫融化的過程中，水分子和NaOH分子在冰晶反復形成和生長過程中產生的機械力作用下突破甲殼素顆粒致密的結構限制，進入甲殼素顆粒內部，在慢速凍結過程中(－18℃和－25℃)，冰晶的形成和生長均較緩慢，形成的冰晶較大，產生的破壞力較強，能夠較多破壞分子間和分子內氫鍵，促進甲殼素溶解。但是，當處理溫度低于－30℃，凍結和擴散的過程短暫，形成的冰晶比較細膩，產生的破壞力不夠大，因此不能大幅度提高溶解性。在－18℃以上的溫度處理，由于濃NaOH溶液尚未凍結，未有足夠的冰晶用來破壞氫鍵，且其擴散性亦不強，因此也不能顯著提高甲殼素溶解性。

2.1.4 料液比對甲殼素溶解性的影響 由圖4可知，甲殼素與溶劑的比例低于1∶4時(如1∶3)，溶解性較低，1∶4 時，溶解性最好，大于1∶4 時，隨著 NaOH 用量的增加并不能顯著提高樣品溶解性。非常有趣的是，料液比1∶10時，樣品的溶解性較差，幾乎未溶解，但離心后的沉淀用10%堿液洗滌時又有大量殘渣溶于NaOH溶液中?？赡茉蚴荖a+和OH－均能產生較強的凈結構形成效應，當NaOH絕對過量時，由凍融作用形成的強制滲透作用不足以抵消凈結構形成效應帶來的滲透阻力。由此可知，凍融循環條件下，料液比1∶4時甲殼素溶解性最好，料液比過低，溶液不能充分地滲入甲殼素顆粒內部，接觸不均勻，即使在反復凍融的情況下亦不能充分破壞甲殼素晶體結構，溶解度自然不高;料液比過高，凈結構形成效應使大量多余的水聚集在粉末顆粒外表面，使反復凍融過程中形成的機械力破壞作用僅僅發生在甲殼素顆粒的表層或淺表層，難于最大限度地提高溶解性。

圖3 冷凍溫度對甲殼素在堿溶液中溶解性的影響

圖4 料液比對甲殼素在堿溶液中溶解性的影響

2.1.5 甲殼素溶解機理探討 圖5嘗試圖示了甲殼素分子在濃堿液中于凍融循環處理過程中的溶解過程。首先，甲殼素在室溫條件下在濃堿溶液中充分吸附膨潤，此時由于甲殼素結構的致密性，大量的NaOH和水分子很難滲透進甲殼素分子內部，只能吸附在其表層或淺表層(a);在冷凍條件下，隨溫度降低，水分子逐漸凍結，由于冷凍濃縮效應，使NaOH的滲透性加大，部分水分子和NaOH分子進入甲殼素顆粒內部，并且脫乙酰過程緩慢進行(b);隨著溫度的繼續下降，低溫效應取代濃縮效應，NaOH和水分子的滲透作用停止，但已經滲透進去的水分子和NaOH分子開始形成冰晶并緩慢長大，在冰晶機械力的作用下部分分子間氫鍵被打破(c);樣品經緩慢解凍，并重新凍結，在冰晶的不斷作用下，越來越多的氫鍵被破壞，導致甲殼素分子最終能夠溶于堿溶液中(d)。

2.2 放置時間對甲殼素濃溶液穩定性的影響

甲殼素溶解于NaOH溶液后即形成一種高聚物溶液，具有一定的粘度，在存放過程中粘度的變化，可以作為衡量甲殼素溶液穩定性的一個指標。高聚物已有研究表明，相同條件下，相對分子質量越大，表觀粘度越大，這是因為在大量出現鏈纏結的臨界分子量以上，分子鏈愈長，分子間的纏結點愈多，表觀粘度就愈大，可以通過溶液粘度的變化近似反映分子量大小的變化［17］。圖6描述了甲殼素均相溶液在放置過程中表觀粘度的變化情況。

圖5 凍融循環處理甲殼素在堿溶液中的溶解示意圖

圖6 靜置時間對甲殼素溶液表觀粘度的影響

從圖6中可以看出，甲殼素堿溶液的粘度在放置初期(84h左右)隨時間的推移不斷下降，起初下降速率較快，36h時表觀粘度下降約1/2，之后逐漸變慢，幾乎不變;84h后粘度驟然上升，96h左右幾乎呈凝膠狀。β糖苷鍵對酸不穩定，對堿穩定，但在高濃度堿長時間作用下仍會不同程度地發生水解反應。反應起始階段，甲殼素在NaOH的作用下迅速脫乙酰并發生糖苷鍵水解反應，致使分子量迅速下降，分子內與分子間氫鍵被破壞，結構變得松散，粘度不斷下降;繼續放置，脫乙酰反應繼續進行，然而，隨脫乙酰度(DDA)的增加，分子中氨基含量逐漸增加，分子堿性逐漸增加，分子間和分子內重新形成氫鍵網絡，分子開始趨向于凝膠，這與殼聚糖稀酸溶液遇堿發生絮凝的現象極其相似。散亂無序的甲殼素分子在氫鍵作用下逐漸聚集并開始交聯形成凝膠網絡，粘度降低得越來越慢;當形成凝膠的趨勢大于降解程度時，甲殼素分子迅速凝聚，粘度突然升高，直到最后形成半固體狀凝膠。結合實驗室前期研究結果，甲殼素溶液靜置反應48～72h即可獲得水溶性較好的半脫乙酰水溶性殼聚糖，也就是當甲殼素溶液粘度降低至原溶液粘度的1/2左右時，終止反應即可獲得水溶性產物，這為大規模生產水溶性殼聚糖時快速判斷反應終點提供依據。

3 結論

凍融循環處理能夠顯著破壞甲殼素分子內、分子間強氫鍵相互作用，破壞甲殼素高度規整的分子結構，使其結晶度下降，進而溶解于一定濃度的NaOH溶液中。甲殼素與一定量的40%NaOH混合物－18℃下凍融3次，能夠在10%NaOH溶液中幾乎完全溶解，而且NaOH的用量大大降低。經過兩次凍融處理的樣品形成的均相溶液，在25℃放置在84h以內進行緩慢的降解和脫乙酰反應，之后隨脫乙酰程度加劇，自由氨基含量增多，重新形成分子間氫鍵相互作用，溶液表觀粘度迅速增大，最終形成凝膠狀。放置48h左右，表觀粘度下降為初始粘度的一半，具有良好的水溶性。結果表明，利用FTC過程中反復形成和生長的冰晶產生的機械力破壞作用，能夠破壞甲殼素晶體結構，從而導致其溶解性增強。為制備既可溶于水又保留其原有特性的高活性水溶性甲殼素提供了可能。凍融循環對甲殼素凝聚態結構的影響有待進一步研究。

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Effects of freezing－thawing cyclic treatment on the solubility of chitin in alkaline solution

LIU Ting－guo1，2，LI Bin1，*，SONG Xue1，LU Zhi－min2，WANG Rui－xia2，WANG Xin2
(1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;2.Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0084－05

2009－08－28 *通訊聯系人

劉廷國(1982－)，男，碩士，講師，研究方向:農副產品深加工與應用。

國家“863”資助項目(2007AA10Z310);池州學院化學材料與工程省級實驗中心建設項目。