豆漿中皂甙的提取及測定

喬兆揚，曹 慧，徐 斐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

豆漿中皂甙的提取及測定

喬兆揚，曹 慧*，徐 斐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

大豆皂甙具有眾多對人體有益的生理功能和生物活性，決定了它具有廣泛的開發價值和應用前景。采用乙醇、正丁醇提取豆漿中皂甙，并通過香草醛法測定其含量，探討了提取溫度、提取時間、豆漿與乙醇的配比及水飽和正丁醇的用量對豆漿中皂甙含量的影響。確定豆漿中大豆皂甙最優提取工藝條件:反應時間為3h，豆漿與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應溫度為75℃，此條件下，每100mL豆漿中皂甙含量為89.668mg。

大豆皂甙，比色法，提取

Abstract:Soyasaponin has wide development and applicative prospect due to its beneficial physiological functions and biological activities for people.The saponins in soybean milk can be extracted using ethanol and butanol and detected by vanillin.The effects of the temperatures，times，the ratio of soybean milk to alcohol and the saturation of normal butanol on extraction were investigated.The results suggested that the optimum extraction conditions were temperature for 75℃，the time for 3h，the mass ratio of soybean milk to alcohol for 1∶5 and the volume for butanol at 90mL.In this condition，the concentration for soyasaponins was 89.668mg per 100mL soybean milk.

Key words:soyasaponin;colorimetric determination;extraction

豆漿是大豆經過研磨后與水混合而成的乳白色飲品，因其營養豐富，口感好，越來越受到人們的青睞。豆漿中除了含有豐富的優質蛋白質及多種人體所需的微量元素，還富含不飽和脂肪酸、大豆皂甙、異黃酮等幾十種對人體有益的物質，在降低人體膽固醇，防止高血壓，增強機體免疫力和抗腫瘤等方面［1－3］具有很好的功效。其中大豆皂甙是一種具有廣泛應用價值的天然生物活性物質，已經普遍應用于醫藥、食品、化妝品、飼料等行業中［4］。豆漿中的皂甙屬于三萜類齊墩果酸型化合物，是三萜類同系物的羥基和糖分子環狀半縮醛上的羥基失水縮合而成［5］。豆漿中皂甙含量的準確測定對于豆漿的加工工藝具有重要的指導意義，目前測定皂甙的方法主要有比色法、高效液相色譜法等。比色法因其方便快捷而被廣為應用，但對其前處理條件即豆漿中皂甙的提取一直缺乏系統完整的研究，在一定程度上制約了其應用，故采用比色法來測定豆漿中皂甙的含量并對其提取條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇(75%)、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯 上海高信化波儀器有限公司，分析純;乙醚、正丁醇、無水甲醇、香蘭素 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;齊墩果酸標準品(純度＞99%) 國藥集團化學試劑有限公司，色譜純。

DX－SZ4電熱恒溫水浴鍋 上海華連醫療器械有限公司;N－1000旋轉蒸發儀 EYELA;SHZ－88臺式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠;722S分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制方法

1.2.1.1 齊墩果酸標準溶液的配制 精確稱取齊墩果酸10mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度為0.2μg/μL的標準溶液，搖勻，備用。

1.2.1.2 水飽和的正丁醇與正丁醇飽和的水的配制

取60mL正丁醇和40mL水充分混合，靜止分層，上層為水飽和的正丁醇，下層即為正丁醇飽和的水。

1.2.2 大豆皂甙的提取 稱取30.00g大豆，洗凈，加入150mL水浸泡12h，用濾網濾干大豆表面水分，并稱重。稱量好的大豆放入料理機，加入500mL水打磨，再用4層過濾網過濾。量取20mL豆漿濾液，以1∶5的比例加入75%的乙醇100mL，于80℃恒溫水浴鍋中提取5h。對提取液過濾，取濾液60mL置于旋轉蒸發瓶中，在旋轉蒸發儀上蒸干，加入去離子水10mL溶解，并轉移入分液漏斗中，用40mL乙醚分兩次進行脫脂，取下層、上層收集液加入10mL去離子水洗滌，棄去醚層，取下層，與之前下層合并。然后用水飽和過的正丁醇60mL分3次萃取，取上層，再用20mL正丁醇飽和的水洗滌萃取液，去上層，移入旋轉蒸餾瓶，于旋轉蒸發儀上揮干正丁醇后，用甲醇定容至10mL，備用。

1.2.3 影響大豆皂甙提取的單因素分析 根據相關資料報道及前期預實驗的結果表明，水浴提取的時間、溫度、豆漿與乙醇的配比、水飽和的正丁醇的使用量都是影響豆漿中皂甙制備的主要因素。因此以豆漿中皂甙含量為評價依據，考察提取時間、溫度、乙醇的濃度以及水飽和正丁醇的用量對皂甙提取的影響。

1.2.4 大豆皂甙提取條件的優化 通過對單因素實驗的結果分析，確定以提取時間、提取溫度、豆漿與乙醇的配比以及水飽和的正丁醇用量作為主要因素，并且以豆漿中皂甙提取量為評價指標，設計四因素四水平正交實驗。選用L16(45)正交設計表進行實驗，確定最佳提取條件。實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.5 比色法測定大豆皂甙的含量 吸取已制備的皂甙100μL于試管中，放入60℃恒溫水浴振蕩器中揮去甲醇，分別在實驗管和空白管加入香草醛－冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL。加蓋置于70℃水浴反應15min。反應完畢后，立即放入冰水中冷卻2min，再分別加入5mL乙酸乙酯。混勻后，在558nm［6］處測定吸光值，根據標準曲線計算豆漿中皂甙的含量。

2 結果與討論

2.1 香草醛法測定豆漿皂甙及標準曲線的繪制

采用香草醛法對皂甙進行定量測定時，香草醛－冰醋酸濃度、高氯酸用量、反應時間和反應溫度都是影響吸光值不可忽視的因素，因此本實驗采用預實驗確定最佳的反應條件并對其進行測定。

采用齊墩果酸作為標準品，準確吸取0、100、200、300、400、500、600μL 齊墩果酸標準溶液置于10mL具塞試管中，于60℃水浴中揮去甲醇，加入新配制的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL搖勻，70℃水浴保溫15min，取出后立即用冰水冷卻，加入5mL乙酸乙酯，搖勻。以不加標準品的溶液為空白，558nm處測定吸光值。以吸光值和齊墩果酸濃度作圖，得到回歸方程:y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987。如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標準曲線的繪制

2.2 水浴時間對皂甙提取量的影響

由圖2可見，提取液中皂甙含量隨著提取時間的增加呈先增大后降低的趨勢，在提取時間為5h時濃度最高。在提取時間為1h時，由于提取時間不足，萃取不夠充分，因此提取液中皂甙含量偏低。而如果水浴時間達到7h，提取液中皂甙含量則呈下降的趨勢，這可能是因為長時間的高溫反應，會使豆漿中皂甙的活性成分發生降解，故而提取出的皂甙含量降低。即最佳的提取時間為5h。

圖2 時間對提取皂甙含量的影響

2.3 水浴溫度對皂甙提取量的影響

由圖3可知，在初始升溫階段皂甙含量隨著提取溫度的增加呈現上升的趨勢，但當水浴溫度達到90℃時，皂甙含量明顯降低。這可能是因為隨著溫度的升高，一開始溫度會對皂甙的提取起促進作用，當提取溫度超過80℃后會對豆漿中的活性成分——皂甙造成破壞，使其發生分解，所以皂甙含量會呈現急劇下滑的現象。即80℃為最佳提取溫度，此時的皂甙提取量最高。

圖3 溫度對提取皂甙含量的影響

2.4 豆漿與乙醇的配比對皂甙提取量的影響

由圖4可知，皂甙含量隨豆漿與乙醇的配比的增加成均勻上升趨勢，當豆漿與乙醇的配比達到1∶7的時候，皂甙含量的增加趨勢趨于平緩。當乙醇的量不充分時，未能充分提取豆漿中的活性物質，而且提取液也不夠澄清，呈渾濁、多懸浮物狀。即確定最佳的豆漿與乙醇的配比為1∶5。

2.5 水飽和正丁醇的用量對皂甙提取量的影響

由圖5可知，提取液中皂甙含量隨著水飽和正丁醇用量的增加而增加，用量越多，萃取的皂甙含量越大，萃取也越充分，但隨著其萃取用量進一步增加，提取液中皂甙含量的增加逐漸趨于平緩。正丁醇萃取法是將脫了脂的豆漿用乙醚萃取過后，用水飽和的正丁醇萃取，靜置，皂甙主要留在正丁醇相中，故水飽和正丁醇的用量越多，所萃取出的包含在正丁醇相中的皂甙含量就越多。當水飽和正丁醇用量超過90mL時，對提取液中皂甙含量的影響就不顯著了。

表2 正交實驗結果與極差分析

表3 正交實驗方差分析表

圖4 豆漿與乙醇配比對提取皂甙含量的影響

2.6 豆漿中皂甙提取條件的優化

通過單因素實驗分析，選取反應溫度、反應時間、豆漿與乙醇配比及水飽和正丁醇用量進行L16(45)正交實驗［7］，實驗方案及結果見表2。

極差分析結果表明(見表2)，影響提取液中皂甙含量的主次因素順序為B＞C＞D＞A，即反應時間＞豆漿與乙醇配比＞水飽和正丁醇用量＞反應溫度。不考慮交互作用，提取豆漿中皂甙含量的較優工藝條件為B2C3D3A2，即反應時間為3h，豆漿與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應溫度為75℃。由于因素A和因素D對提取豆漿中皂甙含量的影響很小，因此可確定14號實驗即為實驗較優組合。此條件下，每100mL豆漿中含有的皂甙量為83.994mg。

在極差分析的基礎上，對實驗進行了方差分析，結果見表3。

圖5 水飽和正丁醇用量對提取皂甙含量的影響

3 結論

采用乙醇、正丁醇提取豆漿中皂甙，通過單因素及正交實驗確定豆漿中皂甙最優提取工藝條件為:反應時間為3h，豆漿與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應溫度為75℃。此條件下豆漿中皂甙提取量為每100mL豆漿中含有皂甙量為89.668mg。

采用比色法測定豆漿中皂甙，以5%香草醛－冰乙酸溶液為顯色劑，顯色時間為15min、顯色溫度為70℃。在 558nm下測定，所得回歸方程為 y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987，線性可靠，曲線高度顯著。此方法簡便快捷，適于實驗室使用。

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［4］胡學煙，王興國.大豆皂甙的研究進展(Ⅰ)——皂甙的分布、結構及其性質［J］.中國油脂，2001，26(4):29－33.

［5］許金新，陸安國.大豆皂甙的生理功能及應用［J］.中國飼料博覽，2003(10):11－13.

［6］魏靜，張春紅，劉長江.比色法測定大豆總皂甙的研究［J］.糧油加工，2006(10):60－62.

［7］王欽德，楊堅.食品實驗設計與統計分析［M］.北京:中國農業大學出版社，2007:503.

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Extraction and determination of the saponins in soybean milk

QIAO Zhao－yang，CAO Hui*，XU Fei
(Institute of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

TS214.2

B

1002－0306(2010)08－0258－04

2009－08－28 *通訊聯系人

喬兆揚(1986－)，男，在讀碩士，研究方向:食品質量與安全。