堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白工藝的研究

高 光，牟光慶

(大連工業大學生物與食品工程學院，遼寧大連116034)

堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白工藝的研究

高 光，牟光慶*

(大連工業大學生物與食品工程學院，遼寧大連116034)

對堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的原料預處理及水解工藝條件進行了研究。結果表明，柞蠶絲素蛋白經硝酸鈣處理后可明顯提高酶對其的水解程度。當濃度為10g/L時，堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適條件是:pH9.3，加酶量7.5%，溫度49℃。水解12h時，柞蠶絲素肽的得率為31.4%。

柞蠶絲素蛋白，堿性蛋白酶，硝酸鈣，水解

Abstract:The tussah fibroin pretreatment and hydrolysis conditions of alkali protease were investigated.The results showed that the hydrolysis degree of alkali protease on tussah fibroin was enhanced obviously after calcium nitrate handling.The optimum hydrolysis conditions were pH9.3，49℃，7.5%content of alkali protease with 10g/L substrate mass concentration for 12h.The yield of tussah fibroin peptide was 31.4%.

Key words:tussah fibroin;alkali protease;calcium nitrate;hydrolysis

柞蠶絲素肽作為一種純天然蛋白質，在化妝品、食品、醫藥等領域的開發應用愈來愈受到廣泛關注。酸法生產絲素肽，雖然可使絲素蛋白水解充分，但會導致色氨酸全部破壞，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸部分破壞。而堿法能夠引起消旋作用，從而降低絲素肽營養價值［1］。酶水解反應因條件溫和對氨基酸破壞小而成為降解絲素蛋白的最有前途的方法。酶水解前一般采用不同濃度的 CaCl2溶液或者 CaCl2、C2H5OH、H2O 三元體系處理蛋白質［2－4］，其中對桑蠶絲的鈣鹽處理已有廣泛研究，而對柞蠶絲鈣鹽處理的研究還比較少［5］。本文對堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的硝酸鈣處理及水解工藝條件進行了研究，以期提高柞蠶絲素肽的得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柞蠶繭殼 由大連工業大學生物與食品工程學院提供;堿性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

722型光柵分光光度計，精密pH計，冷凍干燥機，電熱恒溫水浴鍋，高速離心機，MWCO14000透析袋。

1.2 實驗方法

1.2.1 柞蠶絲素肽制備的工藝流程

柞蠶繭殼清洗、剪碎→二次脫膠→絲素蛋白→鹽處理→透析→酶解→滅酶→離心→絲素肽

1.2.2 水解度(DH)的測定 采用茚三酮法［3］。

式中:h為水解后1g蛋白質被裂解的肽鍵毫摩爾數;htot為1g原料蛋白質的肽鍵毫摩爾數;10.195為1g絲蛋白含有的肽鍵毫摩爾數(可以由組成該蛋白質氨基酸的含量計算出)。

1.2.3 柞蠶絲素肽得率的測定 采用質量法。

式中:S為絲素肽得率;m1為水解液中可溶性蛋白含量，g;m2為脫膠后絲素蛋白含量，g。

1.2.4 實驗設計 影響柞蠶絲素蛋白水解度的四個主要因素為水解時間、溫度、pH以及加酶量E/S。以水解度為指標，通過實驗，確定當其他三因素水平一定時，獲得最大水解度的單因素條件分別為:水解14h;50℃;pH9.5;加酶量10%。由于水解度在水解12h以后基本不再上升，所以正交實驗中水解時間確定為12h。實驗采用Design－Expert7.1.6系統提供的的Box－Behnken正交實驗，實驗因素及水平見表1。

表1 實驗影響因素及水平

2 結果與分析

Design－Experrt是應用廣泛的實驗設計軟件，利用它可以對實驗數據進行統計分析，擬合曲線、建立數學模型，利用其提供的三維立體圖形，觀察響應曲面，獲得實驗最佳條件。

2.1 響應面結果分析

3因素3水平部分正交實驗結果見表2。

表2 Box－Behnken正交實驗結果

2.2 回歸方程的建立與分析

表3回歸模型方差分析表明，對DH所建立的回歸模型極顯著(P＜0.01)。決定系數R2=0.9923，信噪比(Adeq Precision)=23.879，這表明回歸方程的擬合度和可信度均很高，可用于預測DH。Y的變異系數(CV)=1.9%，數值較低。CV值越低，實驗的可靠性越高，表明本實驗操作可信。

以DH為響應指標，利用Design Expert軟件對表4進行二次多元回歸擬合，得到DH對編碼自變量A、B、C的二次多項回歸方程:

Y=9.03－0.34A－0.24B+0.28C+0.2AB+0.23AC+0.12BC－0.97A2－1.22B2－0.89C2

表3 DH回歸模型方差分析

2.3 影響因素的主次關系

各因素的均方值可以反映出各個因素對實驗指標的影響程度，均方值越大，說明對實驗指標的影響程度越大。從表3可知，影響水解度的3個因素順序是:pH＞加酶量＞溫度。

2.4 正交實驗中各個因素之間的交互作用分析

為了觀察pH、溫度、加酶量某兩個因素同時對DH的影響，現根據回歸方程繪其對DH影響的等高線圖和響應曲面圖，分別如下:

從圖1中可以看出，當水解溫度在50℃左右，pH9.5左右時，堿性蛋白酶對柞蠶絲素蛋白的水解作用達到最大，水解度最高。這是因為水解液的pH影響底物分子的解離狀態以及酶活性部位有關基團的解離，從而影響酶與底物的結合和催化作用;在此環境下酶達到最適溫度50℃后，溫度繼續升高，引起酶變性，酶促反應速度開始逐步下降。

圖1 Te與pH之間關系響應曲面

從圖2中可以看出，當加酶量在7.5%左右，pH9.5左右時，堿性蛋白酶對柞蠶絲素蛋白的水解作用達到最大，水解度最高。酶用量超過7.5%以后，水解度開始下降，這主要是因為酶濃度過大會發生自溶(自水解)現象，導致對底物水解作用減弱。

圖2 E/S與pH之間的響應曲面

從圖3中可以看出，當加酶量在7.5%左右，50℃左右時，堿性蛋白酶對柞蠶絲素蛋白的水解作用達到最大，水解度最高。

圖3 E/S與Te之間的響應曲面

通過回歸方程，可以得到當水解時間為12h時，堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適水解條件為:水解溫度48.95℃，pH9.33，加酶量7.5%。該條件下最大水解度為9.09%。

2.5 柞蠶絲素肽的得率

采用上述得到的最適水解條件進行水解，將水解液以6000r/min離心10min，上清液冷凍干燥后測其質量。經測定，柞蠶絲素肽的得率為31.4%。由此可見，柞蠶絲素蛋白分別經過硝酸鈣和文獻［5－6］中報道的氯化鈣處理后，再經水解作用，絲素肽的得率前者是后者的10倍，本研究較大程度地提高了經酶作用后柞蠶絲素肽的得率。

3 結論

3.1 堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適水解條件是:pH9.3，加酶量為7.5%，水解溫度49℃。

3.2 經硝酸鈣處理后的柞蠶絲素，明顯提高了酶對其作用效果，增加了柞蠶絲素肽的得率，水解12h，絲素肽得率達到31.4%。

［1］李圣春，張學松，徐水.絲素肽開發應用及其前景［J］.蠶學通訊，2008，28(4):39－43.

［2］周鳳娟，許時嬰，楊瑞金，等.絲素肽的制備及其理化性質研究［J］.西北農林科技大學學報，2007，35(12):167－171.

［3］黃雷，王學英，崔霞，等.酶法水解絲素蛋白最佳條件的研究［J］.安徽農業科學，2006，34(3):428－429.

［4］Joo－Hong YEO，Kwang－Gill LEE，Hae－Yong KWEON，et al.Fractionation of Silk Fibroin Hydrolysate and Its Protective Function of Hydrogen［J］.Journal of Applied Polymer Science，2006，102(1):772－776.

［5］何建新，喻紅芹.鈣鹽處理對柞蠶絲結構與性能的影響［J］.河南工程學院學報:自然科學版，2008，20(2):13－15.

［6］AKITOSHIAJISAWA.Dissolution ofsilk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution［J］.日本蠶絲學雜志，1998，67(2):91－94.

Conditions of alkali protease hydrolyzing tussah fibroin

GAO Guang，MU Guang－qing*
(School of Biology and Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

TS201.2+5

B

1002－0306(2010)08－0245－03

2009－09－02 *通訊聯系人

高光(1984－)，女，碩士研究生，研究方向:蛋白質資源利用。

大連市科技項目(2007B10NC139)。