HPLC分析比較提取方法對(duì)天麻活性成分的影響

余 蘭，婁方明，張新申

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴州遵義563003;2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065)

HPLC分析比較提取方法對(duì)天麻活性成分的影響

余 蘭1，2，婁方明1，張新申2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴州遵義563003;2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065)

分析比較不同提取方法對(duì)天麻藥材中活性成分提取的影響。以天麻生藥材為分析對(duì)象，比較微波輔助提取、超聲波提取、冷凝回流提取3種提取方法對(duì)天麻素提取率的影響。采用高效液相(HPLC)測定其提取的天麻素含量，條件為 Angilent Tc－C18(4.6mm ×250mm，5μm)色譜柱，V(乙腈)∶V(0.05%磷酸)=15∶85 為流動(dòng)相，流速 0.5mL/min，檢測波長221nm，柱溫25℃。天麻素在4.28～214μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.02%(RSD=1.52%)。微波輔助提取法提取天麻素得率為1.613%，超聲波法提取天麻素得率為1.215%，冷凝回流提取天麻素得率為0.703%。對(duì)于天麻生藥材，不同提取方法對(duì)活性成分天麻素的提取影響較大，建議選用微波輔助提取法作為天麻素的提取方法。本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC方法具有良好的精密度、重現(xiàn)性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為天麻藥材及天麻素類產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

天麻，天麻素，高效液相色譜法(HPLC)，提取

Abstract:The effects of the gastrodine content of the active component in Gastrodia elata were compared and analyzed by different extracting methods.The raw Gastrodia elata was used and the concentration of gastrodine determined by HPLC after three extracting techniques.HPLC method was performed on as the mobile phase was a mixture of acetonitrile－0.05%phosphoric acid(v∶v=15∶85)at 25℃，the chromatographic column was Agilent Tc－C18(416mm × 250mm，5μm)，the flow rate was 0.5mL/min，and the detection wavelength was 221nm.The calibration curve was linear(R2=0.9998)in the range of 4.28～214μg for gastrodin，the average recovery was 100.02%with RSD 1.52%.The ratios of gastrodine was 1.613%by the microwave extracting method，the ratios of gastrodine were 1.215%，0.703%respectively by ultrasonic extracting method and circumfluence extracting method extraction，which was higher than other extracting methods by raw material.Different methods have evident extracting effects on the gastrodine with raw material.According to active component most suitable microwave extracting method should be adopted.The HPLC method built by this study is stable，reliable，and which can be used as a quality control item for Gastrodia elata and the gastrodine products.

Key words:Gastrodia elata Bl.;Gastrodine;high performance liquid chromatography;extracting

天麻(Gastrodia elata Blume)為蘭科植物天麻(Gastrodia elata Bl.)的干燥塊莖，為常用名貴中藥。該藥性平、味甘，具有平肝熄風(fēng)，止痙之功效。臨床上用于治療頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)等癥［1］，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，天麻還具有增智、健腦、延緩衰老和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用［2］。天麻主要含天麻素、甾醇、有機(jī)酸、多種氨基酸、多糖、核苷和淀粉等成分［3－4］，其中的最主要活性成分是天麻素。隨著天麻藥理和臨床研究的深入，天麻藥用產(chǎn)品的開發(fā)研制工作日益得到關(guān)注。以天麻為主要原料的中成藥現(xiàn)已成為許多制藥廠的重要產(chǎn)品，另外，還有天麻片、天麻膠囊、天麻口服液、天麻酒、天麻定眩寧、天麻蜂王漿、天麻益腦沖劑等產(chǎn)品［5］。在食品開發(fā)方面，有蜜餞、飲料、含片、糖果等。天麻的藥食兼用、保健功能方面研究仍具有重大潛在價(jià)值。天麻產(chǎn)品的開發(fā)與研究應(yīng)從簡單的粗加工向深加工、提取、精制轉(zhuǎn)化，擴(kuò)大其藥用，提高其藥的質(zhì)量和藥效［6－7］，因此提取天麻活性成分并建立其測定方法具有十分重要的意義。天麻藥材的質(zhì)量控制，2005版藥典采用天麻素為對(duì)照品進(jìn)行定性、定量分析［1］。不同炮制方法［8－10］和提取方法對(duì)天麻活性成分的提取均有影響。為了更好地利用我國的天麻資源，本文采用HPLC法測定了微波輻射提取法、超聲提取法、冷凝回流提取法3種不同的提取方法對(duì)天麻素提取率的影響，該法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可為天麻產(chǎn)品的開發(fā)利用及含量檢測提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天麻藥材 市售，由遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥學(xué)教研室楊建文副教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elate Bl.，粉碎，粉末過80目篩，80℃干燥1h備用;天麻素對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110807－200205，80℃減壓干燥1h備用;乙腈 色譜純，Sigma公司;水 超純水;其它試劑 均為分析純。

Agilent1100高效液相色譜儀 配有 Tc－C18(416mm×250mm，5μm)色譜柱;1100 G1315A 二極管陣列檢測器、1100 G1311A四元泵、1100配套化學(xué)工作站 美國Agilent公司;KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AL204電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Anke TGL－16C型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FZ植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;MAS－II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;艾柯DZG－303A型純水儀 成都唐氏康寧科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天麻素的提取

1.2.1.1 冷凝回流法提取 精密稱取天麻粉末5.0g，將天麻粉末置于150mL圓底燒瓶中，加入70%甲醇60mL，浸泡2h后，稱定重量。加熱回流提取3h，放冷后，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，將提取液進(jìn)行離心分離并收集上層清液，取上層清液5mL移至50mL容量瓶中，用70%的甲醇水溶液定容，搖勻并經(jīng)0.45μm過濾膜過濾、超聲波脫氣后待檢測。

1.2.1.2 微波提取 精密稱取天麻粉末5.0g，將天麻粉末置于150mL圓底燒瓶中，加入70%甲醇60mL，浸泡2h后，稱定重量，置于MAS－II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站中，裝好冷凝管，在功率400W，溫度50℃條件下，作用9min。放冷后，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足損失的重量，將提取液進(jìn)行離心分離并收集上層清液，取上層清液5mL移至50mL容量瓶中，用70%的甲醇水溶液定容，搖勻并經(jīng)0.45μm過濾膜過濾、超聲波脫氣后待檢測。

1.2.1.3 超聲波提取 精密稱取天麻粉末5.0g，將天麻粉末置于250mL錐形瓶，加入70%甲醇60mL，稱定重量，浸泡2h后，置于KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗器中，在功率300W，溫度55℃條件下，作用30min。放冷后，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足損失的重量，將提取液進(jìn)行離心分離并收集上層清液，取上層清液5mL移至50mL容量瓶中，用70%的甲醇水溶液定容，搖勻并經(jīng)0.45μm過濾膜過濾、超聲波脫氣后待檢測。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 天麻素對(duì)照品備用液的配制 稱取在80℃減壓干燥1h的對(duì)照品42.8mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液。再取5mL此儲(chǔ)備液于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得天麻素對(duì)照品備用液，濃度為428μg/L。

1.2.2.2 天麻素色譜條件 色譜柱:Angilent Tc－C18柱(5μm，4.6mm ×250mm);柱溫 25℃;流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(0.05%磷酸)=15∶85;檢測波長 221nm;流速0.5mL/min;進(jìn)樣量10μL。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取“1.2.2.1”配制的天麻素對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分別置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度 4.28，8.56，21.4，42.8，85.6，128.4，171.2，214.0μg/L的天麻素樣品溶液，0.45μm微孔濾膜濾過，分別進(jìn)樣10μL。以峰面積對(duì)天麻素進(jìn)樣量做線性回歸，得回歸方程 Y=16.275x－11.751，R2=0.9998。結(jié)果表明天麻素進(jìn)樣量在4.28～214μg/L范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為128.4μg/L的對(duì)照品溶液10μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣8次，結(jié)果測定天麻素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.94%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同批天麻樣品，精密量取已知含量的樣品9份，分別加入一定量的天麻素對(duì)照品，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，測定天麻素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

1.2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，每隔2h進(jìn)樣10μL，共測10次，以天麻素面積計(jì)算得其RSD%為1.23%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批天麻樣品，照“1.2.1.2”方法，制備5份，進(jìn)行測定。以天麻素含量計(jì)算，RSD為0.97%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法HPLC色譜圖比較

采用反相高效液相色譜法測定了天麻素的含量，天麻素對(duì)照品和天麻樣品色譜圖見圖1～圖4，三種不同的提取方法的提取液都在8.2min左右有天麻素的色譜峰。

圖1 天麻素對(duì)照品色譜圖

圖2 冷凝回流法提取樣品色譜圖

圖3 微波輔助法提取樣品色譜圖

圖4 超聲波法提取樣品色譜圖

為達(dá)到天麻樣品提取液中天麻素與其它物質(zhì)基線分離的目的，使其它物質(zhì)對(duì)天麻素測定基本不形成干擾。選用不同比例的乙腈－0.05%磷酸為流動(dòng)相，考察流動(dòng)相對(duì)色譜行為的影響，最后選用乙腈－0.05%磷酸(15∶85)為流動(dòng)相，流速為0.5mL/min，天麻素提取樣品得到較好分離，峰形良好。本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC方法具有良好的精密度、重現(xiàn)性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為天麻藥材及天麻素類產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

2.2 樣品含量測定

稱取15批天麻樣品，按“1.2.1”提取方法進(jìn)行提取，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，將所得峰面積代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中天麻素的含量，結(jié)果詳見表2。結(jié)果表明，對(duì)相同量的天麻樣品中天麻素的提取，微波提取效率明顯高于超聲提取法和傳統(tǒng)提取法。

表2 天麻中天麻素不同提取方法含量比較

3 討論

本文提供了適合天麻素提取的三種方法，微波提取法與冷凝回流、超聲提取法相比，不僅提取效率高，而且提取時(shí)間短、節(jié)約能源。微波提取法有利于甲醇溶液滲透穿過天麻的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，較好地將天麻素從天麻物質(zhì)中溶出，從而獲得較高提取率。提取天麻素時(shí)，推薦采用微波提取法。微波作為一種新型、高效、便捷、快速的提取手段，顯示出越來越大的優(yōu)勢，將日益應(yīng)用到中草藥大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn)中。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部［S］.第五版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:39.

［2］張赫名 .天麻的研究進(jìn)展［J］.中藥研究與信息，2005，7(11):19－22.

［3］國家中醫(yī)藥管理局(中華本草)編委會(huì).中華本草第8卷［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:716－722.

［4］金文珊，田德薔.天麻的藥理和化學(xué)研究概況［J］.中藥研究與信息，2000，2(6):21.

［5］張宏杰，周建軍，李新生.天麻研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(1):17－20.

［6］謝笑天，李海燕，王強(qiáng)，等.天麻化學(xué)成分研究概況［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(3):22－24.

［7］張夢娟，徐懷德，牛素哲，等.天麻多糖水提取工業(yè)優(yōu)化研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(11):119－121.

［8］秦俊哲，張潔，周涵.不同炮制方法對(duì)天麻素含量的影響［J］.中藥材，2006，29(12):1285－1288.

［9］王興，周明眉.天麻中有效成分的提取工藝［J］.華西藥學(xué)，2003，18(4):269－270.

［10］高國英，魏曉舒.超聲處理對(duì)天麻飲片含量測定的影響［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2000，8(1):61－62.

Effects of extracting methods on active component in Gastrodia elata by HPLC analysis

YU Lan1，2，LOU Fang－ming1，ZHANG Xin－shen2
(1.Department of Pharmacy，Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China;2.College of Light Textile and Food Science，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

TS201.1

A

1002－0306(2010)08－0220－03

2010－01－19

余蘭(1971－)，女，副教授，在讀博士研究生，主要從事天然產(chǎn)物活性成分分離領(lǐng)域的研究。

貴州省衛(wèi)生廳2006年度科研計(jì)劃項(xiàng)目;遵義市科技基金項(xiàng)目(遵義市科合社字:200706號(hào))。